[發明專利]鑒定根腫病菌4號生理小種的特異基因、特異性引物、含有所述引物的試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201810366659.7
• 申請日: 2018-04-23
• 公開（公告）號: CN108315471B
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發明（設計）人: 楊輝;鄭靜;付寅冬;黃云;張煜輝;易春霖
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所(普通合伙) 11305
• 代理人: 黃綠雯

本發明提供基因PBRA003268在檢測根腫病菌4號生理小種中的應用，所述基因的序列如SEQ No.1所示。本發明還提供根腫病菌4號生理小種的檢測方法，包括以待測樣品的DNA為模板，用特異引物進行PCR擴增；通過擴增產物判斷檢測樣品是否含有根腫病菌4號生理小種。本發明還提供檢測根腫病菌4號生理小種的基因類型的特異基因及方法。本發明的檢測方法可以直接對感病植物組織總DNA進行PCR鑒定，具有操作簡化、所需材料少的特點，能夠適用于不同地區、不同侵染時期的植物組織的根腫菌生理小種鑒定，還實現了區分4號生理小種的不同基因類型的快速檢測，通過應用于田間動態變化監測，為抗病品種的合理布局提供指導依據。

【技術領域】

本發明涉及分子生物學領域。具體涉及用于檢測根腫病菌4號生理小種的特異基因和用于檢測根腫病菌4號生理小種基因類型的特異基因及其應用。

【背景技術】

根腫病是制約十字花科作物生產的一種世界性病害。它由蕓薹根腫菌(PlasmodiophorabrassicaeWoron)引起，主要危害植株的根部，使其根部細胞發生畸形變化，擠壓維管束，影響對水分和養分的吸收，從而使植株地上部分萎蔫或死亡，嚴重影響十字花科作物產量。其寄主范圍包括十字花科330個屬，3700 個種的植物。目前世界范圍內已經有80個國家或地區報道有根腫病發生，在我國28個省均有分布，特別在西南，東北和華中地區尤為嚴重，并呈現加速蔓延的態勢，造成極大危害。

由于根腫菌在土壤中存活時間長，傳統農業防治很難奏效，化學防治易對環境造成污染，栽培抗病品種則是一種較為有效的防治手段，是從根本上解決根腫病危害的途徑。但由于根腫菌存在明顯的小種分化，所推廣的抗病品種必須結合當地生理小種種類及組成；此外，在抗病品種的應用中，由于病原菌與宿主的相互作用，相互選擇，使得一些本來抗病的品種經多年種植，抗性也會減弱甚至喪失。因此，根腫菌生理小種的鑒定以及田間變化的動態監測是根腫病抗病品種合理應用的基礎。

根腫菌生理小種鑒定一直以來都是依據病原菌與鑒別寄主之間的互作結果，通過癥狀進行判別，其中Williams鑒別系統(4個鑒別寄主)和ECD(Europeanclubrootdifferentialhost)鑒別系統(15個鑒別寄主)應用最為廣泛。當前，已有許多科研工作者利用這兩種體系對世界范圍內各個地區的小種進行鑒定。2008 年，沈向群首次用Williams鑒別系統對吉林、遼寧、四川和山東這四個省大白菜產區的15個菌系，丁云花(2013)對云南，重慶，湖北，山東，陜西，四川，上海，遼寧18個菌系進行鑒定，均表明中國目前的優勢生理小種為4號。近年湖北，湖南，東北，安徽，西藏，云南也陸續對各個省進行了較為細致的小種鑒定(盧桂香etal.2013；彭沙莎etal.2013；趙楊etal.2013；方春華etal.2014；劉峰etal.2013)，各省的鑒定結果(除了湖南)都指出4號小種為我國的優勢小種。

但這兩種鑒別系統亦存在缺陷，例如利用鑒別寄主鑒定生理小種費時費力；結果易受根腫菌休眠孢子成熟程度和活力的影響；癥狀的形成需要較長時間，在此期間，根腫菌的侵染和擴展易受溫度和濕度等環境因素的影響；田間根腫樣品多為復合群體，也會影響與鑒別寄主之間互作的結果。基于此，建立對根腫菌生理小種鑒定的一種準確、方便、快速的分子方法，尤其是優勢小種4號的鑒定，對我國根腫病的防治具有重要意義。據報道，目前僅發現基因Cr811可以將5號與3號和8號生理小種區分(Zhangetal.2015)，一個RAPD分子標記存在于1號生理小種(Soméetal.1996)。但用于根腫菌生理小種分子鑒定的特異基因極少，其分子鑒別體系極不完善，針對4號生理小種的分子鑒定目前還未有報道。

【發明內容】

本發明的目的是克服現有技術對于根腫病菌(P.brassicae)生理小種4號難以鑒別、現有技術的鑒定方法中存在周期長且結果易受環境因素影響、鑒別寄主不易擴繁等問題，提供了根腫病菌生理小種4號的分子鑒定方法，并將其應用于根腫病菌4號生理小種，從而建立一種高效、快速、準確判斷根腫菌4號生理小種的鑒定方法。