[發明專利]一種用于檢測大麥黃花葉病毒的LAMP引物組及檢測方法

在審

• 申請號: 201810365523.4
• 申請日: 2018-04-23
• 公開（公告）號: CN108315493A
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發明（設計）人: 陳志偉;趙凱;毛水花;陸瑞菊;劉成洪;黃劍華;宗迎杰;張述偉;杜亞楠;范小瑞;姜琪;張琪;張曉霞;張皖靜;吳文靜
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司 31114
• 代理人: 張曉敏;費開逵

1.一種用于檢測大麥黃花葉病毒的LAMP引物組，其包括外引物F3和B3，內引物FIP和BIP，從5’端到3’端，具體序列如下：

F3:5’-CGCAACTACAGTGATGAAAC-3’；

B3:5’-TCGGAAGTTAACATGGTGTT-3’；

FIP:5’-GAAGCGCCATGCTTCATTGATTTTCGTCTTACTCATCACAAACAAC-3’；

BIP:5’-CGATTTCTTCGTCCCACGATCATTTTTCAGTTCCAAGTGCTGCTA-3’。

2.一種包含權利要求1所述LAMP引物組的大麥黃花葉病毒的LAMP檢測試劑盒。

3.如權利要求2所述LAMP檢測試劑盒，其特征在于，包含LAMP反應體系，該LAMP反應體系包括：內引物FIP、內引物BIP、外引物F3、外引物B3、buffer、dNTPs、甜菜堿和DNA聚合酶Bst。

4.如權利要求2所述LAMP檢測試劑盒，其特征在于，所述LAMP反應體系中，各成分的終濃度為：內引物FIP為0.2-1.6μM，內引物BIP為0.2-1.6μM，外引物F3為0.1-1.6μM，外引物B3為0.1-1.6μM，dNTPs為0.2-0.4mM、甜菜堿為0.4-0.8M，DNA聚合酶Bst為0.16-1U/μL。

5.如權利要求2所述LAMP檢測試劑盒，其特征在于，所述的LAMP反應體系中，各成分的終濃度為：內引物FIP為0.8μM，內引物BIP為0.8μM，外引物F3為0.8μM，外引物B3為0.8μM，10×buffer，dNTPs為0.3mM、甜菜堿為0.6M，DNA聚合酶Bst為0.32U/μL。

6.如權利要求2所述LAMP檢測試劑盒，其特征在于，所述LAMP反應體系中，還含有大麥黃花葉病毒的陽性質粒模板。

7.一種大麥黃花葉病毒的LAMP檢測方法，包括以下步驟：

1)提取待測樣品總RNA，進行反轉錄，獲得cDNA；

2)配制LAMP反應體系；

所述LAMP反應體系中，各成分的終濃度為：內引物FIP為0.2-1.6μM，內引物BIP為0.2-1.6μM，外引物F3為0.1-1.6μM，外引物B3為0.1-1.6μM，10×buffer，dNTPs為0.2-0.4mM、甜菜堿為0.4-0.8M，DNA聚合酶Bst為0.16-1U/μL；

3)進行LAMP擴增反應

利用步驟2)的LAMP反應體系，對步驟1)獲得的cDNA進行LAMP擴增，以ddH₂O為陰性對照，以包含大麥黃花葉病毒目的序列的質粒為陽性對照，獲得對應的擴增產物；

LAMP擴增反應的程序為：55-65℃30-60min，80-85℃3-5min；

4)鑒定擴增結果

步驟3)LAMP擴增反應結束后，向擴增產物中加入SYBR Green I染料，觀察顏色變化：陽性對照顯色為綠色，陰性對照顯色為橘色；待測樣品顯色為綠色的樣品為陽性，含有大麥黃花葉病毒；顯色為橘色的樣品為陰性，不含大麥黃花葉病毒。

8.根據權利要求6所述大麥黃花葉病毒的LAMP檢測方法，其特征在于，在所述的LAMP反應體系中，各成分的終濃度為：內引物FIP為0.8μM，內引物BIP為0.8μM，外引物F3為0.8μM，外引物B3為0.8μM，10×buffer，dNTPs為0.3mM、甜菜堿為0.6M，DNA聚合酶Bst為0.32U/μL。

9.如權利要求1所述LAMP引物組用于大麥黃花葉病毒的RT-LAMP檢測方法中。

10.根據權利要求9所述的RT-LAMP檢測方法中，其特征在于，所述RT-LAMP檢測方法中，以含大麥黃花葉病毒的大麥葉片RNA為模板，反應體系中各成分的終濃度為：內引物FIP為0.2-1.6μM，內引物BIP為0.2-1.6μM，外引物F3為0.1-1.6μM，外引物B3為0.1-1.6μM，10×buffer，dNTPs為0.2-0.4mM、甜菜堿為0.4-0.8M，DTT為0.1-10mM，逆轉錄酶ReverTra Ace為1-5U/μL，DNA聚合酶Bst為0.16-1U/μL，待測樣品RNA≥0.001ng/μL，反應程序為：60-65℃30-60min，80-85℃3-5min。