[發明專利]甜高粱蔗糖合成酶基因的表達檢測方法及擴增引物

在審

• 申請號: 201810364932.2
• 申請日: 2018-04-23
• 公開（公告）號: CN108315394A
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發明（設計）人: 李玥瑩;李雪梅;逄洪波;馬蓮菊;鄒劍秋;王蘭蘭;張穎;李春陽;白露;張煒彤
• 申請（專利權）人: 沈陽師范大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/48;C12N15/11
• 代理公司: 沈陽維特專利商標事務所(普通合伙) 21229
• 代理人: 楊群

1.甜高粱蔗糖合成酶基因擴增引物，其特征在于，包括引物SS-1和引物Actin，引物SS-1包括SS-1正向引物和SS-1反向引物，核苷酸序列分別如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；引物Actin包括Actin正向引物和Actin反向引物，核苷酸序列分別如SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4所示。

2.甜高粱蔗糖合成酶基因cDNA的合成方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)cDNA第一條鏈的合成

使用TaKaRa RT-PCR試劑盒，反應體系為10μl，包括：5×PRT Mix 2μl，RNA模板8μl；反應條件為：37℃15min，85℃5s，反轉錄產物于-20度保存；

2)cDNA的擴增

PCR反應體系為25μl，包括：10×Buffer 2.5μl，100μmol/l dNTPs 0.5μl，0.2μmol/lF-Primer 0.8μl，0.2μmol/l R-Primer 0.8μl，cDNA 0.5μl，Taq酶0.5μl，ddH₂O 19.4μl，所述引物為權利要求1所述的引物SS-1或引物Actin；

PCR反應條件為：94℃預變性3min→30次擴增循環→72℃延伸10min，擴增循環包括：94℃變性30s→58℃退火30s→72℃延伸45s；

3)cDNA的檢測

用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，100V電泳20min，在凝膠成像儀上檢測cDNA的合成情況。

3.甜高粱蔗糖合成酶基因表達的快速熒光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步驟：

用SYBR Premix ExTaq II進行Real-time PCR擴增，以甜高粱的cDNA為模板，進行目的基因、內參基因的擴增，每個樣本設置3次重復，同時設置空白對照；

反應體系20μl，包括：2×SYBR Premix ExTaq II 10.0μl，ddH₂O 6.0μl，ForwardPrimer 0.8μl，Reverse Primer 0.8μl，ROX Reference DYE 0.4μl，cDNA模板2.0μl；所述引物為權利要求1所述的引物SS-1或引物Actin；

PCR反應程序為：95℃預變性30s→40個擴增循環→72℃延伸10min，擴增循環包括：95℃變性5s→60℃退火20s→72℃延伸30s；

溶解曲線程序60-95℃，反應完成以后，電腦自動生成CT值、熔解曲線。