[發(fā)明專(zhuān)利]一種檢測(cè)黑猩猩腺病毒AdC68的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810364446.0
• 申請(qǐng)日: 2018-04-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108828210A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-11-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王寧;吳冠軍;石慧穎
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 天津津斯特生物技術(shù)有限責(zé)任公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/535
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/535;G01N33/569
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種檢測(cè)黑猩猩腺病毒AdC68的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法，其主要步驟特征為：

（1）包被抗體：純化抗體用包被緩沖液（碳酸鈉溶液）稀釋?zhuān)罴寻粷舛葹?：50，每孔100ul，4℃過(guò)夜；

（2）封閉：洗滌后，用PBST（含0.1%吐溫20的PBS）配制2% BSA，每孔200ul，37℃封閉2hr；

（3）捕獲抗原：標(biāo)準(zhǔn)參考品和待測(cè)定樣品用含2%羊血清PBST稀釋?zhuān)訕恿繛?00ul，37℃孵育1hr；

（3）加入酶標(biāo)抗體：洗滌后，加HRP標(biāo)記的羊抗腺病毒HEXON（購(gòu)自Invitrogen），使用濃度為1：500，每孔100ul，37℃孵育1hr；

（4）顯色：洗滌后，用含0.01%TMB的顯色液100ul，室溫避光顯色30min；

（5）讀數(shù):加每孔50ul 2M H₂SO₄溶液終止，450/630nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸收值。

2.如權(quán)利要求1所述，標(biāo)準(zhǔn)參考品是經(jīng)純化處理過(guò)的非復(fù)制型黑猩猩腺病毒68型（AdC68GFP），制備為如下步驟：

（1）將非復(fù)制型黑猩猩腺病毒68型病毒以MOI1~10的比例，接種靜置培養(yǎng)的HEK293單層細(xì)胞，待細(xì)胞完全病變后，收獲病變的細(xì)胞；

（2）凍融三次后，劇烈震蕩裂解細(xì)胞釋放病毒；

（3）再經(jīng)過(guò)兩次不連續(xù)氯化銫密度梯度超速離心獲得純化病毒，純化病毒再通過(guò)脫鹽柱處理后，用含10%甘油的PBS保存于-70℃超低溫冰箱中備用。

3.如權(quán)利要求1所述，包被抗體是經(jīng)純化過(guò)的兔抗AdC68抗體，制備方法如下：以權(quán)利要求2中純化病毒接種家兔，采集免疫家兔血清，測(cè)定中和滴度，取不低于中和滴度/1280的抗血清經(jīng)硫酸銨沉淀粗純，再經(jīng)Protein G粗純，獲得純化抗體。

4.如權(quán)利要求1所述，標(biāo)準(zhǔn)參考品的稀釋度為1/10、1/20、1/40、1/80、1/160、1/320、1/640，對(duì)應(yīng)濃度為7.76ug/ml、3.88ug/ml、1.94 ug/ml、0.97 ug/ml、0.48 ug/ml、0.24 ug/ml、0.12 ug/ml、0.06 ug/ml。

5.如權(quán)利要求2所述，用Lorry法測(cè)定純化重組病毒蛋白濃度，標(biāo)準(zhǔn)品蛋白濃度為38.8ug/ml,殘留HEK293蛋白含量低于0.3ug/ml。