[發(fā)明專利]一種用于副豬嗜血桿菌分子分型的全基因組測序方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810364415.5
• 申請日: 2018-04-23
• 公開（公告）號: CN108588198A
• 公開（公告）日: 2018-09-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 閆鶴;萬銹琳;李春玲
• 申請（專利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/689;C12Q1/04;C12R1/21
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 何淑珍;江裕強(qiáng)

本發(fā)明公開了一種用于副豬嗜血桿菌分子分型的全基因組測序方法。該方法通過全基因組序列在副豬嗜血桿菌MLST分型數(shù)據(jù)庫中找到7個看家基因（rpoB、atpD、g3pd、infB、mdh、_6pgd、frdB），并確定看家基因的等位基因號及序列型，包括樣品預(yù)處理、提取基因組DNA、質(zhì)量檢測與測序，采用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進(jìn)行多序列比對與分析，獲得菌株序列型（ST）。同時發(fā)現(xiàn)了3個新的等位基因及兩株副豬嗜血桿菌ST型均為新型。該技術(shù)流程可以用于副豬嗜血桿菌分類鑒定和遺傳多樣性研究。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種動物病原菌分子分型技術(shù)，具體涉及一種基于全基因組測序用多位點(diǎn)序列分型(MLST)技術(shù)對副豬嗜血桿菌(Haemophilus Parasuis)進(jìn)行分型的方法。

背景技術(shù)

副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis strains,HPS)是巴氏桿菌科的一種短小革蘭氏陰性菌，主要危害仔豬和青年豬。該病菌是豬上呼吸道的一種常在細(xì)菌，在特定條件下可以侵入機(jī)體引起嚴(yán)重的全身性疾病，其主要特征是以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為主，該病原引起的疾病又被稱為“革拉氏病”。

目前，副豬嗜血桿菌病在我國乃至全世界廣泛流性，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，是世界性病害之一，已引起人們廣泛的關(guān)注。此外，副豬嗜血桿菌極易產(chǎn)生耐藥性，且血清型眾多，每個血清型之間缺乏免疫交叉性，因此至今仍沒有一個很好的控制副豬嗜血桿菌病流行的方法。

全基因組測序，即對一種生物的基因組中的全部基因進(jìn)行測序，測定其DNA的堿基序列。全基因組測序覆蓋面廣，能檢測個體基因組中的全部遺傳信息；準(zhǔn)確性高，其準(zhǔn)確率可高達(dá)99.99％。隨著基因組測序技術(shù)的進(jìn)步，基于全基因組序列的分型分析技術(shù)更為全面的提供了病原細(xì)菌的海量信息，對于病原細(xì)菌的鑒定非常有效。準(zhǔn)確而高分辨率的分型信息為流行病學(xué)變化以及擴(kuò)散范圍的檢測與預(yù)警奠定了基礎(chǔ)，同時也為臨床診斷提供了依據(jù)。然而，分辨率不高嚴(yán)重影響了基于看家基因一代測序結(jié)果對臨床菌株的診斷。而全基因組測序就目前來說費(fèi)用還較高，計(jì)算和分析方法還需要進(jìn)一步完善，用于日常監(jiān)測的可行性還較低。

多位點(diǎn)序列分型(MLST)技術(shù)是直接利用5—10個看家基因的核普酸序列片段之間的堿基差異進(jìn)行分子分型的方法。看家基因是有保守代謝功能的基因，進(jìn)化相對緩慢，通過序列中堿基的變化可反映菌株之間的遺傳關(guān)系和進(jìn)化關(guān)系。在MLST結(jié)果分析中，每個單一的核普酸差異即可視為一個新的等位基因(allele)，把每個來自于同一看家基因的不同等位基因用阿拉伯?dāng)?shù)字編號，由此使得每個菌株中看家基因的等位基因都有相應(yīng)的編號，最終可得到該菌株的由一串?dāng)?shù)字組成的等位基因號碼，即該菌株的序列型(SequenceType,ST)。通過MLsT分型不僅可以判斷菌株之間的親緣關(guān)系，而且還可以推斷它們是否有共同祖先,因此MLST技術(shù)被廣泛地用于細(xì)菌病原菌的分類中。此外，多位點(diǎn)序列分型技術(shù)也可用于病原菌株遺傳多樣性和分子進(jìn)化研究，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由于該方法分辨率高，并克服了其他方法存在的不同實(shí)驗(yàn)室或?qū)嶒?yàn)室內(nèi)部的結(jié)果可比性及重復(fù)性較差的缺陷，所以相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)果可通過網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)共享和對比。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于建立一種基于全基因組測序的副豬嗜血桿菌的多位點(diǎn)序列分型技術(shù)體系，提供一種用于副豬嗜血桿菌分子分型的全基因組測序方法。

用于副豬嗜血桿菌分類鑒定和遺傳多樣性研究，所要解決的關(guān)鍵問題是副豬嗜血桿菌基因組DNA的提取、看家基因序列的確定、看家基因比對與分析、等位基因號與分型號的申請。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種基于全基因組測序的副豬嗜血桿菌分子分型方法，該方法成功提取細(xì)菌基因組DNA，用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進(jìn)行多序列比對，再于副豬嗜血桿菌MLST數(shù)據(jù)庫中在線比對，確定7個看家基因序列，獲得各個菌株序列型(ST)。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：