[發明專利]一種制備羊梭菌病基因工程亞單位疫苗的方法

有效

• 申請號: 201810364027.7
• 申請日: 2018-04-23
• 公開（公告）號: CN108578686B
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發明（設計）人: 杜恩岐;張磊;蘇靜
• 申請（專利權）人: 楊凌凱瑞生物科技有限公司
• 主分類號: A61K39/08
• 分類號: A61K39/08;A61P31/04;C12N15/70;C12N15/31;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京貴都專利代理事務所(普通合伙) 11649
• 代理人: 李新鋒

1.一種制備羊三聯四防基因重組亞單位疫苗的方法，通過原核表達相關毒素蛋白，和佐劑配成疫苗，接種免疫實驗動物進行效果評價，其特征在于通過以下步驟完成:

1)分別克隆產氣莢膜梭菌α毒素蛋白基因，腐敗梭菌α毒素蛋白基因，產氣莢膜梭菌β1毒素蛋白基因，產氣莢膜梭菌ε毒素蛋白基因，以上毒素抗原N端分別攜帶flagellin、flagellin、invasin和padre佐劑并克隆至表達載體pVEXK-HN-MBP-MCS-K6EE-His，得到四種重組表達質粒：

pVEXK-HN-fMBP-TEV-flagellin-CPA-K6EE-HIS；

pVEXKHN-fMBP-TEV-INVASIN-CPB-K6EE-HIS；

pVEXK-HN-fMBP-TEV-flagellin-CSA-K6EE-HIS；

pVEXK-HN-ptMBP-TEV-PADRE-ETX106-K6EE-HIS；

所述的步驟1)中產氣莢膜梭菌α毒素蛋白基因序列為序列表中的SEQ ID NO:1，其對應的產氣莢膜梭菌α毒素氨基酸序列為SEQ ID NO:2；

所述的步驟1)中產氣莢膜梭菌β1毒素蛋白基因為序列表中的SEQ ID NO:3，其對應的產氣莢膜梭菌βl毒素氨基酸序列為SEQ ID NO:4；

所述的步驟1)中腐敗梭菌α毒素蛋白基因序列為序列表中的SEQ ID NO:5，其對應的腐敗梭菌α毒素氨基酸序列為SEQ ID NO:6；

所述的步驟1)產氣莢膜梭菌ε毒素蛋白基因序列為序列表中的SEQ ID NO:7，其對應的產氣莢膜梭菌ε毒素氨基酸序列為SEQ ID NO:8；

所述的步驟1)中Flagellin佐劑基因序列為序列表中的SEQ ID NO:9,其對應的Flagellin短肽佐劑氨基酸序列SEQ ID NO:10；

所述的步驟1)中Invasin短肽佐劑基因序列為序列表中的SEQ ID NO:11,其對應的Invasin短肽佐劑氨基酸序列SEQ ID NO:12；

所述的步驟1)中PADRE短肽佐劑基因序列為序列表中的SEQ ID NO:13,其對應的PADRE短肽佐劑氨基酸序列SEQ ID NO:14；

所述的步驟1)中TEV裂解位點基因序列為序列表中的SEQ ID NO:15,其對應的TEV裂解位點氨基酸序列SEQ ID NO:16；

所述的步驟1)中佐劑序列均位于重組蛋白的氨基端；

2)將構建好的4個重組質粒載體分別轉化低內毒素大腸桿菌表達菌株ClearColi?BL21(DE3)，獲得基因工程菌株；

3)將基因工程菌株，接種于LB培養基中誘導培養，將培養后的工程菌使用高壓均質機破菌，離心分離上清，使用親和純化方法純化目的蛋白；

4)純化后的幾種目的蛋白使用TritonX-114處理內毒素并過濾除菌，保存于適當緩沖液；

5)使用內標法進行重組蛋白定量；

6)按照1:1:1:1的比例混合4種重組蛋白并與佐劑等體積乳化配苗；

7)將配好的疫苗免疫家兔進行安全性評價檢測；

8)將配好的疫苗免疫家兔一段時間后采血分離血清，取分離的血清分別和不同劑量4種野生型毒素進行中和實驗，后注射小鼠，觀察小鼠存活情況，評價疫苗效力。

2.根據權利要求1中的方法，其特征在于，所述的步驟7)中安全性評價檢測包括一次單劑

量安全試驗、單劑量重復接種試驗以及一次超劑量安全試驗。

3.一種羊三聯四防基因重組亞單位疫苗，其特在在于，所述疫苗由權利要求1-2中任意

一項方法制備得到。