[發(fā)明專利]隧道磁場技術分離和富集外周血中稀有細胞的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810362931.4
• 申請日: 2018-04-21
• 公開（公告）號: CN108546676A
• 公開（公告）日: 2018-09-18
• 發(fā)明（設計）人: 金彩科;熊禮寬;梁卉;趙媛
• 申請（專利權）人: 深圳市紅莓生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;C12N5/09
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了一種利用隧道磁場技術分離和富集外周血中稀有細胞（胎兒有核紅細胞、循環(huán)腫瘤細胞等）的方法，其步驟包括:（a）將包被目的稀有細胞特異性抗體或核酸適配體的磁珠加入樣品外周血中孵育，使其形成細胞?抗體或核酸適配體?磁珠偶聯(lián)物。目的細胞（胎兒有核紅細胞、循環(huán)腫瘤細胞等)較其他血細胞攜帶的表面抗原數(shù)量更多或與核酸適配體的親和力更強，從而結合更多數(shù)量的磁珠。（b）將抗體或核酸適配體磁珠孵育后的血液樣品流過隧道磁場中的薄膜管，攜帶不同數(shù)量磁珠的細胞因其磁感應強度不同而停留在薄膜管壁的不同位置，從而達到稀有細胞（胎兒有核紅細胞、循環(huán)腫瘤細胞等)分離的效果。（c）實施洗滌步驟，去除不攜帶磁珠的細胞。（d）可以在磁場保持下實施細胞的固定、染色和熒光標記；（e）向薄膜管施加負壓使其形成薄膜片，固定分離后的細胞并封切兩端，以便作細胞后續(xù)的鑒定分型（酶學、形態(tài)學和分子生物學檢測等）。與現(xiàn)有技術相比，本方法簡單、快速、穩(wěn)定，自動化程度高，目的細胞丟失少，適用于科研與臨床實驗診斷。

技術領域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領域，特別是涉及一種利用隧道磁場分離和富集外周血中稀有細胞（胎兒有核紅細胞、循環(huán)腫瘤細胞等)的方法。

背景技術

人體外周血中除了紅細胞、白細胞和血小板等之外,有時還可能存在一些稀有細胞，如腫瘤患者外周血中存在循環(huán)腫瘤細胞、孕婦外周血中包含胎兒有核紅細胞和循環(huán)內皮細胞等。這些細胞數(shù)量稀少（1毫升血中僅含有約1-10個），卻具有重要臨床價值。如循環(huán)腫瘤細胞可用于腫瘤的早期診斷、預后評估、療效評價和個體化治療；胎兒有核紅細胞因擁有完整的胎兒遺傳物質，被一致認為是無創(chuàng)性產前基因診斷的最理想靶細胞。

目前外周血中稀有細胞（胎兒有核紅細胞、循環(huán)腫瘤細胞等)的分離和富集方法主要分為非特異性富集方法和特異性富集方法。非特異性富集方法即利用細胞本身的物理特性進行富集。特異性的富集方法是利用細胞表面特異性標志物進行富集。基于以上原理的細胞分離和富集方法多種多樣，包括密度梯度離心法、細胞過濾技術、細胞粘附技術、納米基質分離技術、流式細胞分離技術、微流控芯片技術和免疫磁珠分離技術。由于目的細胞本身的物理性質(如大小、密度和電化學性質等)與其他血液細胞存在部分重疊，非特異的富集方法很難將稀少的目的細胞從外周血中分離出來。流式細胞分選技術是利用流式細胞儀，以高能量激光照射高速流動狀態(tài)下被熒光色素染色的單細胞或微粒，測量其產生的散射光和發(fā)射熒光的強度，從而對細胞性狀及功能狀態(tài)等進行定性或定量檢測的一種現(xiàn)代細胞分析技術。這種方法分離純度較高，但流式細胞儀體積大，造價昂貴，操作復雜；且分選過程中有部分細胞丟失及形態(tài)改變。微流控芯片技術是把樣品制備、反應、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，自動完成分析全過程。該方法所需樣品量小，分離純度較高，但其在工業(yè)化生產和微型化整合等方面還存在一些問題，且儀器及芯片造價昂貴。

免疫磁珠分離技術是目前最為常用的稀有細胞分離技術，它基于抗原通過功能基團與包被在磁珠上的特異性抗體相結合，形成抗原-抗體-磁珠復合物,這種復合物具有較高的磁響應性,在磁場的作用下定向移動，使復合物與其他物質分離，而達到分離富集細胞的目的。現(xiàn)有的免疫磁珠分離方法通常在免疫磁珠分離柱上進行，且為提高細胞純度需要多次沖洗（正選/負選），操作繁瑣且易導致目的細胞丟失，常用的微米級磁珠還在一定程度上互相吸引擠壓細胞造成了目的細胞的破壞，這些都影響免疫磁珠分離效果，造成稀有細胞分離富集存在假陰性、假陽性結果，使檢測結果的特異性和靈敏度難以滿足臨床實際工作的需要。另一方面，有些稀有目的細胞表面特異性抗原在其他細胞中也有少量的存在，這也影響了細胞分離的純度。因此，亟需一種操作簡便，成本低廉，穩(wěn)定可靠的稀有細胞分離方法以用于實驗室操作及臨床應用中。

發(fā)明內容

為了克服上述現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了一種利用抗體或核酸適配體磁珠在強磁隧道中分離富集外周血中稀有細胞（胎兒有核紅細胞、循環(huán)腫瘤細胞等)的方法。