[發明專利]蒙脫石封閉活性炭的制備方法、所述方法得到的產品及其應用

在審

• 申請號: 201810360085.2
• 申請日: 2018-04-20
• 公開（公告）號: CN108479705A
• 公開（公告）日: 2018-09-04
• 發明（設計）人: 吳國平;趙遠洋;湯凱潔
• 申請（專利權）人: 江西農業大學
• 主分類號: B01J20/20
• 分類號: B01J20/20;B01J20/30;B01D15/08;C12Q1/6851;C12Q1/689;C12Q1/10;C12Q1/06
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所(普通合伙) 11305
• 代理人: 田燕

本發明的目的是提供一種蒙脫石封閉活性炭的制備方法，包括顆?；钚蕴康奶幚?；以蒙脫石和去離子水制備蒙脫石封閉劑；以封閉劑封閉顆?；钚蕴?，得到蒙脫石封閉活性炭。本發明蒙脫石封閉活性炭能有效消減檢測樣品中干擾PCR聚合酶活性的抑制劑，但不會吸附細菌而影響后續檢測，可應用于多種檢測方法中，以提供活菌檢測效率和靈敏度。

【技術領域】

本發明屬于生物檢測領域，具體涉及利用蒙脫石封閉的活性炭(BCAC)對食品樣品直接前處理精制，將EMA(ethidiumbromide monoazide)結合實時熒光環介導等溫擴增技術(Rti-LAMP)實現快速特異性檢測食品中E.coli O157:H7等食源性致病菌活菌。

【背景技術】

大腸桿菌O157:H7(E.coli O157:H7)是腸出血性大腸桿菌中最常見的血清型，也是其多種血清型中最主要的致病菌株，感染劑量低于5CFU。感染該菌可使人患腹瀉、出血性結腸炎(hemorhabic colitis,HC)，還可引發溶血性尿毒綜合征(hemolytic uremicsyndrome，HUS)及血栓性血小板減少紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)等嚴重并發癥，致死率達5％～10％。

目前檢測E.coli O157:H7的方法主要有傳統分離培養、免疫學和分子生物學檢測。這些方法在不同的檢測要求下都有各自的優點，但是也都存在著一定的不足，比如耗費時間長、操作過程繁瑣以及檢測靈敏度低等。環介導等溫擴增技術自2000年日本科學家Notomi發明報道以來，因其可在等溫條件下數十分鐘內完成核酸的高倍擴增，從而成為繼PCR技術之后又一新型更快速、簡便的分子生物學檢測技術。目前各國研究人員在此基礎上發展出了多種病原菌的LAMP檢測方法。與PCR等其他方法相比，LAMP有著其獨特的優點，如在等溫條件下即可完成擴增反應、反應時間短(40-60min)、靈敏度比較高、而且反應溫度比較低(60-65℃)，甚至可肉眼直接判斷反應結果。

然而這種基于核酸擴增的分子生物檢測方法不能區分活、死細胞，因而無法準確定量檢測樣品中活菌濃度。疊氮溴化乙錠(ethidium monoazide，EMA)能夠穿透破損的細胞壁或細胞膜與DNA共價結合形成耦合物，使其不能發生擴增反應。本發明將EMA結合Rti-LAMP實現快速定量檢測活的E.coli O157:H7。

研究表明食品中存在多種水溶性DNA聚合酶抑制劑，會干擾PCR等分子生物學方法檢測食品中致病菌。活性炭是一種具有較大表面積、復雜孔隙結構的物質，具有良好的吸附性能，可以用來消減干擾PCR聚合酶活性的抑制劑。但由于活性炭同時能吸附細菌，需要對其表面進行適當封閉，從而防止細菌被吸附。本發明使用蒙脫石封閉的活性炭可以消減食品中水溶性抑制劑，同時不影響食品中細菌的回收。

【發明內容】

本發明的目的是提供一種消除檢測樣品中干擾PCR聚合酶活性的抑制劑的方法，使檢測樣品在后續作進一步檢測時能夠提高活菌含量檢測精度。

為了實現上述目的，本發明提供一種蒙脫石封閉活性炭的制備方法，所述方法包括以下步驟：

(1)顆?；钚蕴康奶幚恚喝×綖?.5-3mm的顆?；钚蕴?，用水清洗至流出的水無色清亮，在55℃下烘干備用；

(2)蒙脫石封閉劑的制備：按以g/mL計取1份蒙脫石和50份去離子水，混合后高速勻漿，然后以700rpm離心1min，取上清為封閉劑，備用；

(3)蒙脫石封閉活性炭的制備：以步驟(2)的封閉劑浸沒步驟(1)的顆?；钚蕴?，在35-40℃下搖床中100-150rpm封閉2-4h，然后棄上清，烘干后得到蒙脫石封閉活性炭。

本發明提供的蒙脫石封閉活性炭的制備方法中蒙脫石為粉末狀，其目數不小于300目。

本發明還提供根據上述制備方法得到的蒙脫石封閉活性炭在食品檢測中的應用。