[發明專利]耐鹽氨氧化細菌固定化生物炭球的制備方法及應用

在審

• 申請號: 201810359733.2
• 申請日: 2015-02-17
• 公開（公告）號: CN108587954A
• 公開（公告）日: 2018-09-28
• 發明（設計）人: 黃瀟;李巋然;黨佳佳;李輝;趙陽國;白潔;張穎
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12N1/36;C12N11/14;C02F3/34;C12R1/01;C02F101/16
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 張中南

1.耐鹽氨氧化細菌固定化生物炭球的制備方法，其特征是首先篩選出高效氨氧化細菌，然后對氨氧化細菌進行耐鹽性馴化得到耐鹽氨氧化細菌，其次制得生物炭球，并將制得的數個生物炭球置于耐鹽氨氧化細菌富集液中得到掛膜生物炭球，之后再將上述掛膜生物炭球置于耐鹽氨氧化細菌包埋混合液中并從中取出再逐粒放入飽和硼酸溶液中，最后，將混合液中的生物炭球逐粒放入飽和硼酸溶液中，并放置于冰箱4℃交聯12h，交聯完成后用無菌水清洗，即得到耐鹽氨氧化細菌固定化生物炭球；

上述高效氨氧化細菌的篩選方法，包括如下步驟：

（1）富集培養：稱取干重10g-20g的沉積物，加入到一個盛有100mL富集培養基的250mL錐形瓶中，于150r/min-200r/min，28℃-30℃的條件下震蕩培養數天后吸取10mL至另一個富集培養基中，于上述條件震蕩培養數天，如此重復上述步驟3次以提高氨氧化細菌的濃度，最終得到氨氧化細菌富集液；上述富集培養基為：(NH₄)₂SO₄ 5.5g，CaCO₃ 5.5g，NaCl2.0g，MgSO₄ 0.5g，K₂HPO₄ 1.5g，MnSO₄ 0.01g，FeSO₄ 0.02g，蒸餾水1000mL，5%Na₂CO₃調節pH=8.0，121℃滅菌30min；

（2）純化分離：將上述氨氧化菌富集液按10^-1-10^-7梯度進行稀釋，涂布在固體培養基上，于28℃-30℃培養數天，待菌落長成后，挑選不同形態的菌落在另一個固體培養基上進行反復劃線，直到生成的菌落為不同種單一形態的單一菌，分離得到多株純種氨氧化細菌，上述培養基為：NH₄SO₄ 2g，NaH₂PO₄ 0.25g，MgSO₄·7 H₂O 0.03g，MnSO₄·4H₂O 0.01g，K₂HPO₄0.75g，NaCl 0.01g，CaCO₃ 5g，瓊脂 20g蒸餾水1000mL，5%Na₂CO₃調節pH=7.2，121℃滅菌30min；

上述氨氧化細菌的耐鹽性馴化方法，包括以下步驟：

將上述分離得到多株純種氨氧化細菌挑取到一個富集培養基中于150r/min-200r/min，28℃-30℃的條件下震蕩培養數天，分別得到單菌株富集液；待上述各單菌株富集液進入對數增長期時，以各單菌株富集液與富集培養基5%的接種量依次接種于另一個100mL鹽度為5‰、10‰、15‰和20‰的富集培養基中，于150r/min-200r/min，28℃-30℃的條件震蕩培養數天，即篩選出對氨氮降解效果好的耐鹽氨氧化細菌；

上述生物炭球的制備方法，包括以下步驟：

（1）取秸稈洗凈，烘干至恒重，將秸稈粉碎后過篩，得到秸稈粉末，經過馬弗爐燒制成生物炭；

（2）將上述燒制的生物炭用去離子水清洗若干次，并利用0.1mol/L的硝酸作為改性劑，在200r/min的磁力攪拌條件下，使上述改性劑與生物炭充分混勻，進行改性一天后，再用去離子水清洗至pH為中性得到化學改性生物炭；再將上述的化學改性生物炭置于頻率40KHz的微波清洗儀中微波震蕩40min-90min，過濾，恒溫干燥后得到物化改性生物炭；

（3）再將粘土在恒溫干燥箱中干燥，過100目-200目篩得到粘土粉末；

（4）將上述物化改性的生物炭與粘土粉末按質量比為（0.5-1）：10的比例混合后，加入到硅酸鈉和碳酸氫鈉用去離子水溶解的混合液中，用制球機制成球粒后，再置于恒溫干燥箱中干燥，最后置于馬弗爐燒制成生物炭球，上述硅酸鈉與粘土質量比為3%，碳酸氫鈉與粘土質量比為1.5% ；

上述生物炭球掛膜方法，包括以下步驟：

將生物炭球置于上述耐鹽氨氧化細菌富集液中浸泡4-6天，即得掛膜生物炭球；

上述的包埋混合液是10%聚乙烯醇的水溶液和20%的濕菌體按體積（10-15）：1的比例混合得到的；上述濕菌體是取50ml-100ml的微生物富集液經5000-8000r/min離心10-15min,去除上清液后用無菌水清洗若干次后得到的。