[發明專利]一種蓖麻遺傳轉化方法

在審

• 申請號: 201810359567.6
• 申請日: 2018-04-20
• 公開（公告）號: CN108546710A
• 公開（公告）日: 2018-09-18
• 發明（設計）人: 劉寒冬
• 申請（專利權）人: 劉寒冬
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/38
• 代理公司: 沈陽維特專利商標事務所(普通合伙) 21229
• 代理人: 楊群

1.一種蓖麻遺傳轉化方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)制備轉化受體

蓖麻種子的滅菌：剝掉蓖麻種皮，在錐形瓶中用75％的乙醇滅菌5min，之后用15％的過氧化氫于搖床100rpm震蕩處理15min，最后用無菌水清洗5次；

預培養：取種子的白色胚乳，放置于Rc1培養基中，暗處培養5天至生根發芽，將根和子葉部分切掉后放置于Rc2培養基中，再將Rc2培養基放在超凈工作臺上，光照培養3-7天，至外植體變粗變綠；

2)制備侵染液

取20ml Rc-inf，依次加入20μl AS、10μl DTT、10μl Na2SO3，將農桿菌挑至混合液中，制成侵染液；

3)侵染

將Rc2培養基中的蓖麻放置于超凈工作臺中，用刀在外植體原兩片子葉打開的地方切一下，刀口不超過0.2cm，取50ml的滅菌三角瓶，向其中倒入Rc-inf，沒過瓶底即可，將切好的外植體放入三角瓶中，再將步驟2)制備的侵染液加至三角瓶中，于搖床100rpm侵染15min，之后取出置于無菌濾紙上吹20min；

4)共培養

將步驟3)吹至表面無液體的外植體接至放有滅菌濾紙的Rc-cocu培養基上，暗處培養3天；

5)恢復培養

將共培養后的外植體取出放置于滅菌皿中，觀察切痕處是否變黑，變黑即放入Rc-reco培養基中恢復培養5～10天，當外植體變粗并長出綠色葉子時將其轉接入篩選培養基；

6)篩選

將恢復培養完畢的外植體放入篩選培養基Rc3-Bas2中篩選，篩選過程一次10天，篩選2-3次，至外植體逐漸膨大并在頂端長出新芽，得到轉化外植體；

7)伸長、生根培養

將轉化外植體放置于Rc3培養基中進行伸長，伸長過程一次10天，伸長2-4次；

將伸長至2～3cm的小苗取出，切掉底部愈傷化或黑化部分，再接入Rc4培養基進行生根；

各步驟中用到的培養基具體配方見下表：

上述培養基配方表中的各個代碼代表含義為：

2.如權利要求1所述的蓖麻遺傳轉化方法，其特征在于，所述步驟1)中通過如下方法得到胚乳：夾住剝掉種皮的蓖麻種子有黑點的一端，縱向從一半處切至種子的中心位置，再橫向切開，可觀察到一白色胚乳，用刀挑出。

3.如權利要求1所述的蓖麻遺傳轉化方法，其特征在于，所述步驟2)中制備的侵染液OD₆₀₀＝0.8～1.0。

4.如權利要求1所述的蓖麻遺傳轉化方法，其特征在于，選用的農桿菌為EHA105，農桿菌攜帶的抗性基因為卡納抗性基因，轉基因載體骨架為pCAMBIA3301，轉基因植株篩選標記為草銨膦。

5.如權利要求1所述的蓖麻遺傳轉化方法，其特征在于，所述步驟5)恢復培養和步驟6)篩選過程中，每個培養皿中接入外植體均遵循3-4-4-3原則，共接入14個外植體。