[發明專利]尼古丁選擇性降解菌的構建方法及其在廢煙葉水提液中的應用

有效

• 申請號: 201810359550.0
• 申請日: 2018-04-20
• 公開（公告）號: CN108531501B
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 鐘衛鴻;張輝;李駿;金維華;黃海嬋
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N15/78
• 分類號: C12N15/78;C02F3/34;C02F101/38
• 代理公司: 杭州之江專利事務所(普通合伙) 33216
• 代理人: 朱楓

1.尼古丁選擇性降解菌的構建方法，以Pseudomonas sp.JY-Q為原始菌株，包括下述步驟：

1)通過該菌全基因組信息分析，確定以下五個目的基因：一個葡萄糖激酶基因AA098_22370和四個葡萄糖脫氫酶基因AA098_12490，AA098_22860，AA098_11910和AA098_05800；

2)構建目的基因的敲除載體：設計待敲除目的基因上下游同源臂擴增引物，在上游同源臂的正向引物5’端加入EcoRⅠ酶切位點，在下游同源臂的反向引物5’端加入BamHⅠ酶切位點，以融合PCR擴增出目的基因的上下游同源臂后，利用一步克隆法技術在體外將其與酶切后的線性載體pK18mobSacB重組；

3)利用熱轉法將敲除載體轉化到大腸桿菌缺失菌株WM3064中，然后加入2,6-二氨基庚二酸,以此為供體菌，假單胞菌JY-Q為受體菌進行雙親本接合；之后，由于自殺質粒載體pK18mobSacB無法在假單胞菌中獨立復制，其接合轉化到宿主菌株后會插入到JY-Q的基因組上；利用載體上的Kanamycin抗性基因，可篩選出第一次交換的重組子；

4)將該菌株過夜擴培后，利用載體上攜帶的反篩選標記SacB基因，在反篩選平板，即15％蔗糖平板上，可將發生第二次交換的重組子——即目的基因隨整合入基因組的質粒載體脫落，以實現基因無縫敲除；

5)重復步驟2)至4)，直至敲除全部目的基因。

2.權利要求1所得的尼古丁選擇性降解菌應用于廢煙葉水提液中以降解尼古丁的用途。