[發明專利]一種降低側流層析試紙檢測限的方法

有效

• 申請號: 201810358563.6
• 申請日: 2018-04-20
• 公開（公告）號: CN108663513B
• 公開（公告）日: 2019-08-20
• 發明（設計）人: 嚴秀平;張毅;張曉曉;楊晗婕;曹杭之;馬孝影;黎炎;張現童
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/53;G01N33/531
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了一種降低側流層析試紙檢測限的方法，屬于快速檢測技術領域。本發明方法包括依次線性排列地設置樣品墊、層析膜、吸收墊(不含結合墊)，然后在樣品墊上載樣品溶液使目標檢測物在層析膜的檢測區(T區)預先富集，再在樣品墊和層析膜之間插入結合墊，隨后，繼續在樣品墊上載樣品溶液或者緩沖液。本發明方法實現了檢測限的大幅度降低。與其他基于樣品富集濃縮以降低側流層析試紙檢測限的方法相比，本發明不涉及其他擴增試劑、材料和設備，不增加檢測成本，具有顯著的簡單、便捷、高效等優勢。

技術領域

本發明涉及一種降低側流層析試紙檢測限的方法，屬于快速檢測技術領域。

背景技術

基于側流層析技術制備的快檢試紙即側流層析試紙可用于現場快速檢測小分子、蛋白和核酸等生物大分子以及微生物。此檢測方法易于操作，成本低廉，檢測結果肉眼可見，在臨床診斷、環境監測和食品安全分析等領域已被廣泛應用。目前，主流的側流層析試紙由四個部分組成：樣品墊、結合墊、層析膜和吸水墊，將這四部分疊加于支撐底板上就構成了一個側流層析試紙條。樣品墊為經過處理的纖維膜或玻璃棉，用于快速吸收待檢樣品，使其利用毛細管作用向結合墊方向側向流動；結合墊為纖維膜或玻璃棉，吸附有標記的生物活性材料(如金標抗體)，它可與待檢樣品溶液里的檢測靶標結合形成肉眼可見的免疫復合物從而被檢測區捕獲(基于夾心檢測機理)并使檢測區顏色隨目標物濃度增加而增強，或從而逃離檢測區的捕獲(基于競爭檢測機理)并使檢測區顏色隨目標物濃度增加而減弱；層析膜大都為硝酸纖維素膜，它是側流分析技術中的關鍵材料，為分析物之間的反應提供了平臺，其上固定有一條或多條具有生物活性物質(如抗原或抗體)的檢測線或檢測區以及一條不反應樣品差異、恒定顯色的質控線或質控區，用于攔截帶標記的免疫復合物，并可直觀地顯示檢測結果；吸水墊為吸水紙板，用于吸收流過層析膜的待檢樣品，以平衡層析膜兩邊的壓差，促使更多待檢樣品在層析膜上側向流動。

現有的側流層析試紙主要存在著靈敏度不足、檢測限偏高的缺點，然而，檢測低濃度分析物的技術需求卻在日益增加。因此，努力降低側流層析試紙的檢測限，這是目前側流層析技術發展的熱點。目前有以下幾方面的研究以試圖降低側流層析試紙的檢測限，例如：用熒光量子點替代金納米粒子作為標記物，用儀器檢測熒光信號代替裸眼檢測顯色信號；當目標物使核酸序列時，在試紙上樣分析前采用基于酶的擴增技術提高檢測靶標濃度；利用基于多級探針信號增強技術、溫濕度技術和流體控制技術。雖然，這些先進的平臺實現了比直接上樣法更低的檢測限，但它們基本都使用了如酶等高成本的生化試劑，外部設備或者多步復雜的操作。

在檢測之前快速地濃縮、富集固定體積的樣品，對于提高側流層析技術定量檢測的靈敏度是一種理想方案。例如，紙基等速電泳已被用于基于其電泳遷移率同時分離和濃縮山羊抗小鼠IgG，其在側流層析檢測中產生400倍的信號增強。但是，這種富集技術需要額外的高壓電源，不適合在遠程、現場的快速檢測中使用。此外，有研究者使用聚乙二醇(PEG)或TritonX-114雙水相體系濃縮檢測靶標體積，能夠使檢出限降低一個數量級。然而，這些富集步驟或者需要額外的緩沖液添加步驟，或者需要在垂直放置的條帶底部附近保留粘稠的膠束富集相，這將影響下游分析并使操作過程更復雜。因此，有必要進一步改進側流層析技術，使之在降低檢測限的同時更簡化并更具成本效益，以便更好地用于實時檢測。

經典側流層析的上樣方式有以下兩種，一種是將修飾有識別分子的金納米粒子(AuNPs-DP)干燥于結合墊，將結合墊組裝至試紙條后在樣品墊上載樣品(后面稱之為直接上樣法)，另一種是將AuNPs-DP與樣品混合后上載于樣品墊(后面稱之為預混上樣法)。對于直接上樣法，檢測結果表現出明顯的濃度依賴性，相同上樣體積下檢測區信號只對濃度有響應；由于AuNPs-DP是在液體最前沿流經檢測區和對照區，實際發揮作用的響應體積可能小于10微升，因而增大上樣體積并不會對降低檢出限有任何幫助。對于預混上樣法，首先，操作極微小體積的AuNPs-DP溶液對于現場檢測并不現實，其次，AuNPs-DP的濃度被大幅稀釋，大體積的AuNPs-DP源源不斷的流經檢測區很可能會導致假陽性出現從而影響檢測結果的判斷，因此并不是理想的上樣方式。