[發明專利]鯉科魚類線粒體基因組全序列擴增引物及擴增方法

有效

• 申請號: 201810357829.5
• 申請日: 2018-04-20
• 公開（公告）號: CN108611424B
• 公開（公告）日: 2021-11-16
• 發明（設計）人: 王鵬飛;邱麗華;趙超;范嗣剛;閆路路
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院南海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6806;C12N15/11
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司 44104
• 代理人: 宣國華;劉艷麗

本發明公開了一種鯉科魚類全基因組序列的擴增引物，包括3組分別用于擴增粒體基因組3個長片段序列的外引物和內引物，以及1對測序引物。利用該擴增引物可獲得鯉科魚類的線粒體全基因組序列，為鯉科魚類的保護遺傳學、進化遺傳學及物種的分子鑒定提供物質基礎。本發明還公開了一種鯉科魚類線粒體全基因組的擴增方法，該方法簡便、高效、快捷，且省時、省力更省錢。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及鯉科魚類線粒體基因組全序列擴增引物及擴增方法。

背景技術

線粒體DNA(mtDNA)是線粒體內的遺傳物質，是細胞內相對獨立的基因組。與核DNA相比，mtDNA具有分子較小、結構簡單、呈母系遺傳，并且具有較高的突變率，突變固定后形成的DNA多態性位點可以反映出群體遺傳特征、種群分化和種屬關系等。魚類mtDNA同其他脊椎動物的mtRNA一樣，呈共價閉合環狀，是細胞核外具自主復制、轉錄和翻譯能力的遺傳因子。魚類mtDNA主要包括37個編碼基因(13個疏水蛋白基因、2個rRNA基因、22個tRNA編碼基因)、1個負責復制和轉錄起始的控制區(D-loop)和1個輕鏈復制起始區。由于mtDNA的上述特點，以mtDNA作為分子標記，探討魚類的群體遺傳結構與系統演化，已成為魚類分子群體遺傳學和系統學研究中的熱點。

鯉科(Cyprinidae)是世界現生魚類中最大的一個科，約有210屬2010種。它們廣泛分布在歐亞大陸、東印度群島、非洲和北美。鯉科魚類物種豐度最大的地區是東亞，在中國就有122屬600多種，因此鯉科魚類是研究進化生物學的絕好材料。由于巨大的物種數量，要為鯉科魚類建立一個完整的系統發育系統是非常困難的。鯉科魚類的分類從1817年Cuvier建立以來就不斷地得到修訂和重排，眾多學者根據形態、骨骼特征將鯉科魚類分為不同的亞科。

傳統的依據形態特征推論系統發生關系事實上有一定的局限性，其中一個明顯弊端就是很難排除可能受到趨同適應的干擾。近年來，基于線粒體基因組序列的分子系統學逐漸成為鯉科魚類系統發育研究中的一個熱點和發展趨勢。例如，賴瑞芳等利用線粒體基因組全序列對4種魴屬魚類進行了系統發育分析。目前，已有約500種鯉科魚類公布了線粒體全基因組序列，但仍有1500多種鯉科魚類線粒體基因組序列未知。因此，獲得更多種類的鯉科魚類線粒體基因組全序列已經成為研究鯉科魚類系統發育學研究的迫切需求。

目前，魚類線粒體基因組全序列的獲取方法主要有兩種。第一種是根據已公布的親緣關系較近的物種的線粒體全基因組序列設計并篩選特異性引物對特定的物種線粒體基因組進行擴增，例如中國專利名稱為一種大黃魚線粒體全基因組序列的擴增引物及其應用(申請號CN102776183A)應用16對特異性引物對大黃魚的線粒體全基因組序列進行了擴增，該方法的優勢是引物特異性高，缺點是只能針對單一目標物種；而當需要獲得多種魚類線粒體全基因組序列時，則需要分別根據其親緣關系較近物種設計引物，費時、費力。第二種是基于高通量測序技術獲得線粒體全序列，采用該方法的前提是獲得純化的魚類線粒體，該步驟難度大，對樣品、試劑和操作要求高，成功的概率較低；而且高通量測序費用高昂，不適合用于多個物種的線粒體基因組序列測定；此外，由于高通量測序技術的原理是將DNA打斷后加接頭再進行拼接，經常出現所獲取的序列不能拼接成完整的環狀mtDNA。

綜合以上現狀，開發一種能夠簡便、高效、快捷地擴增鯉科魚類的粒體全基因組序列的方法，省時、省力更省錢。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種通用、高效的擴增魚類線粒體全基因組的擴增引物，利用該擴增引物可獲得鯉科魚類的線粒體全基因組序列，為鯉科魚類的保護遺傳學、進化遺傳學及物種的分子鑒定提供物質基礎。

本發明的目的之二是提供一種鯉科魚類線粒體全基因組的擴增方法，該方法簡便、高效、快捷，且省時、省力更省錢。