[發(fā)明專利]一種異育銀鯽尾鰭細(xì)胞系的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810357416.7
• 申請日: 2018-04-20
• 公開（公告）號: CN108546672B
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 魯建飛;呂利群;許丹;費(fèi)越越;王浩;姜有聲
• 申請（專利權(quán)）人: 上海海洋大學(xué)
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/70;C12Q1/686;C12Q1/6851
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31227
• 代理人: 胡永宏

本發(fā)明公開了一種異育銀鯽尾鰭細(xì)胞系的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，包括：將健康異育銀鯽尾鰭的尾鰭剪下，用75％的酒精消毒處理后剪成大小為1?2mm³的組織塊，均勻移植到培養(yǎng)瓶并將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中，6h后加入5mL完全培養(yǎng)液，每3天更換2.5mL完全培養(yǎng)液，細(xì)胞匯合至95％以上時加入1mL胰蛋白酶消化液，部分細(xì)胞脫落后用完全培養(yǎng)液吹打使細(xì)胞重懸，以1：2傳代培養(yǎng)，細(xì)胞傳至10代后將完全培養(yǎng)液的胎牛血清濃度降至10％，再按照上述步驟繼續(xù)傳代培養(yǎng)至細(xì)胞系穩(wěn)定傳代；上述異育銀鯽尾鰭細(xì)胞系能無限傳代增殖，可用于分離和鑒定鯉皰疹病毒Ⅱ型。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于淡水魚類細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種異育銀鯽尾鰭細(xì)胞系的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

利用細(xì)胞株來鑒定和分離敏感病毒株是世界動物衛(wèi)生組織推薦的最有效的病原分離和鑒定方法，建立不同種類的魚類細(xì)胞株可為病毒分離和鑒定提供豐富的生物學(xué)材料，也為病毒的疫苗研究奠定基礎(chǔ)。目前，已構(gòu)建的異育銀鯽細(xì)胞系只有異育銀鯽腦細(xì)胞系(專利號為US9598671B2)，嚴(yán)重制約了異育銀鯽研究的進(jìn)展。至今為止，只有兩株對鯉皰疹病毒Ⅱ型敏感的細(xì)胞系，一株是金魚尾鰭細(xì)胞系，另外一株是異育銀鯽腦細(xì)胞系。現(xiàn)有技術(shù)中還沒有異育銀鯽尾鰭細(xì)胞系的構(gòu)建方法，能用于分離鑒定鯉皰疹病毒Ⅱ型的細(xì)胞系也很少，長時間缺少敏感細(xì)胞系制約了鯉皰疹病毒Ⅱ型病毒學(xué)的研究進(jìn)展。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究后發(fā)現(xiàn)，異育銀鯽尾鰭細(xì)胞系是一種能無限傳代并可用于鯉皰疹病毒Ⅱ型增殖的永生細(xì)胞系。為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種異育銀鯽尾鰭細(xì)胞系的構(gòu)建方法；本發(fā)明的第二目的還在于提供上述異育銀鯽尾鰭細(xì)胞系在分離和鑒定鯉皰疹病毒Ⅱ型上的應(yīng)用。

本發(fā)明的上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種異育銀鯽尾鰭細(xì)胞系的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)原代培養(yǎng)：將健康異育銀鯽的尾鰭剪下，用75％酒精消毒處理30s，PBS緩沖液洗三遍，再用鑷子輕輕刮除表面黏液，PBS緩沖液洗三遍，然后剪成大小為1-2mm³的組織塊，均勻移植到培養(yǎng)瓶，然后將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中，6h后加入5mL完全培養(yǎng)液，每3天更換2.5mL上述完全培養(yǎng)液；

(2)傳代培養(yǎng)：在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞匯合至95％以上時加入1mL胰蛋白酶消化液，有部分細(xì)胞脫落后用上述完全培養(yǎng)液吹打使細(xì)胞重懸，以1：2(v/v)分瓶傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞傳至10代后，將完全培養(yǎng)液的胎牛血清濃度降至10％；然后按照上述步驟繼續(xù)傳代培養(yǎng)，至細(xì)胞系穩(wěn)定傳代。

步驟(1)中，所述組織塊的預(yù)處理過程具體為：剪取健康異育銀鯽尾鰭，置于含有75％酒精的燒杯中浸泡處理30s，然后用1×PBS緩沖液洗三遍，再用鑷子輕輕刮除表面黏液，PBS緩沖液洗三遍，在無菌環(huán)境中將清洗后的尾鰭剪成大小為1-2mm³的組織塊。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述完全培養(yǎng)液為15％的胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的M199培養(yǎng)液。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述培養(yǎng)瓶為25cm²的一次性培養(yǎng)瓶。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述消化液為質(zhì)量濃度0.05％的胰蛋白酶消化液。

本發(fā)明的第二方面還在于通過上述構(gòu)建方法得到的異育銀鯽尾鰭細(xì)胞系。

進(jìn)一步地，所述的異育銀鯽尾鰭細(xì)胞系核型為三倍體。