[發明專利]一種人外周血Treg細胞的體外分離擴增方法及其應用

在審

• 申請號: 201810353887.0
• 申請日: 2018-04-19
• 公開（公告）號: CN108546678A
• 公開（公告）日: 2018-09-18
• 發明（設計）人: 王文娟;劉雪霞;劉芙君;馬玎;李寧;周小嬌
• 申請（專利權）人: 王文娟
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;A61K35/17;A61P15/06
• 代理公司: 煙臺雙聯專利事務所(普通合伙) 37225
• 代理人: 牟曉丹

本發明涉及一種人外周血Treg細胞的體外分離擴增方法及其應用，屬于細胞體外分離擴增方法及其應用技術領域。包括以下步驟：1)、采集原因不明復發性流產患者配偶的外周血，梯度離心分離出外周血單個核細胞；2)、利用磷酸鹽緩沖液洗滌所述外周血單個核細胞兩次，并對獲得的單個核細胞進行計數；3)、通過磁珠分選技術分離出CD4⁺T細胞、Treg細胞；4)、將Treg細胞進行擴增。本發明不僅可以獲得純度較高的Treg細胞，還可以通過體外擴增的方法獲得臨床應用所需要的細胞數量，本發明獲得的人外周血Treg細胞應用于治療不明原因復發性流產，能顯著提高原因不明反復性流產患者的抱嬰率。

技術領域

本發明涉及一種人外周血Treg細胞的體外分離擴增方法及其應用，屬于細胞體外分離擴增方法及其應用技術領域。

背景技術

復發性流產(Recurrent Spontaneous Abortion，RSA)指患者與同一性伴侶連續發生2次及2次以上自然流產，在育齡婦女中發病率約為5％，此類患者再次妊娠失敗率高達50％以上。RSA病因復雜，臨床上約50％與染色體異常、生殖系統解剖異常、內分泌異常、感染和血栓形成傾向有關，另有50％RSA患者病因不明，稱原因不明復發性流產(URSA)，被認為與母胎免疫排斥有關，是目前亟待解決的難治性不育癥。

連續3次或3次以上流產患者(復發性流產)采用淋巴細胞主動免疫治療(lymphocyte immunotherapy,LIT)于上世紀80年代在國際上獲得成功，在臨床上逐漸得到推廣應用，并在國內取得共識。

近年研究表明，URSA與妊娠免疫耐受異常、生理性免疫抑制反應減弱有關，這涉及到CD4⁺/CD8⁺T淋巴細胞比例和Th1/Th2細胞比例失衡，調節性T細胞數量及功能下降，NK細胞毒力增強，巨噬細胞功能異常，HLA抗原組織相容性增加，封閉抗體產生減少等，從而導致胚胎遭受免疫排斥而流產。但是由于上述實驗室指標變化不夠敏感和穩定，尚未能作為URSA實驗室診斷指標，所以URSA的診斷主要靠臨床排除性診斷，沒有確切的實驗室診斷指標。

申請人自2007年致力于URSA及反復種植失敗的研究。近年來，申請人在2項國家自然科學基金、2項生殖醫學基金的資助下，深入開展URSA的臨床及基礎研究，在其發病原因、發病機制、免疫防治、規范診療等方面上取得了一定的成績。前期研究中，1)我們首次提出母胎“Th17/Treg平衡”理論，我們認為正常妊娠存在Th17/Treg平衡，URSA患者Th17/Treg失衡，偏向Th17；URSA患者外周血、蛻膜中Treg細胞(細胞表面標志CD4+CD25+CD127dim/-)表達降低，確定Treg細胞的表面標志，為URSA患者病因學篩查臨床檢驗提供可靠依據(Wanget al.,2010)。2)URSA患者Treg細胞調控Th17細胞功能降低，Th17細胞表面趨化因子及細胞因子表達異常(Wang et al.,2010)。3)URSA患者巨噬細胞功能異常、Treg細胞調控巨噬細胞的功能異常，正常妊娠婦女Treg細胞能夠有效調控URSA患者Th17、巨噬細胞功能(Wanget al.,2011)。4)注射rIL-17能引起鼠種植率降低、流產率增加，轉輸正常孕鼠Treg細胞能提高種植率及妊娠成功率(Wang et al.,2014)。6)種植期Treg細胞水平、體外倍增的能力以及細胞因子的分泌與種植成敗關系密切，反復種植失敗患者種植期外周血Treg細胞表達降低(Wang et al.,2017)。7)Treg細胞免疫治療URSA患者，提高了抱嬰率(Wang et al.,2017ARSImeeting)。

發明內容

本發明的目的在于解決現有技術中存在的不足之處,提供一種人外周血Treg細胞的體外分離擴增方法，通過本方法不僅可以獲得純度較高的Treg細胞，還可以通過體外擴增的方法獲得臨床應用所需要的細胞數量首次應用于治療原因不明復發性流產。