[發明專利]檢測CAR-T細胞的方法及其應用

有效

• 申請號: 201810349680.6
• 申請日: 2018-04-18
• 公開（公告）號: CN108490174B
• 公開（公告）日: 2022-06-24
• 發明（設計）人: 答亮;王宏飛
• 申請（專利權）人: 上海尚珞生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;C07K16/42
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 崔佳佳;徐迅

本發明提供了一種檢測CAR陽性細胞的方法及其應用。具體地，本發明提供了一種用于檢測CAR陽性細胞的檢測試劑，所述檢測試劑包括：(a)第一檢測試劑，所述第一檢測試劑是第一抗體，所述第一抗體為多克隆抗體，并且所述多克隆抗體特異性結合于CAR的胞外的抗原結合域；和(b)第二檢測試劑，所述第二檢測試劑特異性結合于第一抗體或偶聯于第一抗體的標記物。本發明的檢測試劑和方法靈敏度高、特異性好、檢測結果更為準確性。

技術領域

本發明屬于生物技術和醫學領域，具體涉及一種檢測表達CAR-T的細胞的方法及其應用。

背景技術

隨著腫瘤免疫治療的發展，結合了抗體和免疫細胞優勢的嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)-T細胞免疫治療受到極大關注。

CAR主要由細胞膜外抗原結合區和細胞內信號轉導區通過鉸鏈區及跨膜區構成。膜外抗原結合區具有特異性識別并結合靶細胞表面抗原的功能，其構成源于單克隆抗體的單鏈可變區結構域(Single Chain Variable Fragment， scFv)，由重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)組成。細胞內信號轉導區主要由共刺激信號和T細胞受體(TCR)的CD3zeta鏈組成。表達CAR的T細胞(CAR-T) 通過scFv與靶細胞抗原結合后，胞內信號轉導區將信號傳入T細胞，從而激活T細胞，分泌穿孔素、顆粒酶及細胞因子等，發揮殺傷作用。

目前FDA批準上市了兩款CAR-T細胞藥物，分別是諾華制藥(Novartis)的Kymriah，和吉利德公司(Gilead)的Yescarta。兩款藥物均針對CD19陽性B 細胞腫瘤，采用了相同的抗原結合區，即來源于鼠單克隆抗體FMC63的scFv。

構建CAR-T細胞需要將CAR基因通過病毒或非病毒系統轉染并整合到T細胞基因組上。當該基因正常表達，在細胞膜上形成跨膜的CAR結構時，CAR-T 細胞才具有識別和殺傷靶細胞的活性。因此，準確檢測表達CAR的陽性T細胞是CAR-T藥物質量控制的關鍵步驟，也是臨床上對病人治療劑量控制、過程監控及伴隨診斷的重要環節。

常見的對于CAR-T細胞進行檢測的方法有兩種類型：檢測CAR基因陽性T 細胞和檢測CAR蛋白陽性T細胞。

對于檢測CAR基因陽性T細胞而言，定量實時聚合酶聯反應(Quantitative RealTime PCR,qPCR)是檢測CAR基因陽性T細胞的主要方法。通過qPCR可以檢測細胞基因組上整合的CAR基因，以及CAR基因的拷貝數。但該方法不能準確反映表達CAR的陽性T細胞，因為有一部分整合了CAR基因的T細胞沒有正常表達CAR(Jennifer N.Brudno,et al.,Journal ofClinical Oncology, 2016)，這些T細胞帶來的假陽性降低了qPCR方法應用的準確性。此外，qPCR 方法無法滿足對T細胞多種表面標志物(CD3、CD4、CD8等等)同時檢測的需求，這進一步限制了qPCR方法的應用。