[發(fā)明專利]ATP硫酸化酶活性的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810349280.5
• 申請日: 2018-04-18
• 公開（公告）號: CN108535232B
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 舒咬根;羅永濤
• 申請（專利權(quán)）人: 易尚明天科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/25
• 分類號: C12Q1/25;G01N21/64
• 代理公司: 北京志霖恒遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11435
• 代理人: 郭棟梁

本申請公開了一種ATP硫酸化酶活性的檢測方法，包括以下步驟：(1)先將不同濃度焦磷酸分別和腺苷5’三磷酸、熒光素/熒光素酶混合，得到混合物；(2)將混合物分成兩等份后分別加入測試樣品池和對照樣品池；(3)在對照樣品池中再注入緩沖液，在測試樣品池中注入ATP硫酸化酶；(4)開啟探測儀，檢測測試樣品池中的產(chǎn)物ATP與熒光素/熒光素酶反應(yīng)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度和對照樣品池中的熒光強(qiáng)度，得到熒光強(qiáng)度時(shí)間曲線；(5)針對不同標(biāo)準(zhǔn)濃度的PPi，測得對應(yīng)的F_PPi，生成校準(zhǔn)曲線；(6)制作米氏曲線：(7)根據(jù)米氏公式，擬合所得的Vmax即是衡量ATP硫酸化酶活性參數(shù)；(8)判斷ATP硫酸化酶活性。采用本發(fā)明的檢測方法能夠方便快捷的檢測ATP硫酸化酶活性。

技術(shù)領(lǐng)域

本申請涉及一種檢測方法，具體涉及ATP硫酸化酶活性的檢測方法。

背景技術(shù)

ATP硫酸化酶能夠?qū)⒔沽姿?PPi)與腺苷5’三磷酸(APS)耦合并催化成三磷酸腺苷(ATP)，其活性直接影響催化速率及檢測靈敏度。而PPi是生命體內(nèi)重要的能量代謝分子，對其的快速實(shí)時(shí)定量檢測能間接探測生命體的能量代謝過程，尤其是主要代謝路徑的識別。

現(xiàn)在還沒有一種能夠方便快捷的檢測ATP硫酸化酶活性的方法。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷或不足，期望提供一種能夠方便快捷的檢測ATP硫酸化酶活性的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

一種ATP硫酸化酶活性的檢測方法，包括以下步驟：

(1)先將不同濃度焦磷酸PPi分別和腺苷5’三磷酸APS、熒光素luciferin/熒光素酶luciferase混合，得到不同濃度PPi的混合物；

(2)將每個(gè)PPi濃度的混合物分成體積相同的兩等份，一份加入測試樣品池，另一份加入對照樣品池；

(3)在對照樣品池中再注入緩沖液，在測試樣品池中注入三磷酸腺苷ATP硫酸化酶，則測試樣品池發(fā)生酶促反應(yīng)：

根據(jù)上述反應(yīng)可知：PPi通過上述反應(yīng)以1:1化學(xué)計(jì)量生成ATP，終態(tài)ATP的濃度等同于初態(tài)PPi的濃度；

其中ATP sulfurylase表示三磷酸腺苷硫酸化酶，k₊表示ATP sulfurylase同時(shí)與PPi和APS的結(jié)合速率；k--表示ATP sulfurylase與PPi和APS完全解離的速率；k_cat表示ATPsulfurylase對PPi的催化速率；

(4)開啟反應(yīng)動力學(xué)定量探測儀，檢測測試樣品池中的產(chǎn)物ATP與熒光素/熒光素酶反應(yīng)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，旋轉(zhuǎn)測試轉(zhuǎn)盤后檢測對照樣品池中的熒光強(qiáng)度，在控制器的控制面板中分別顯示測試樣品池和對照樣品池的熒光強(qiáng)度時(shí)間曲線；

(5)針對不同標(biāo)準(zhǔn)濃度PPi的混合物，測得每個(gè)濃度對應(yīng)的PPi熒光強(qiáng)度F_PPi，進(jìn)而生成校準(zhǔn)曲線；

(6)制作米氏曲線：

根據(jù)所得到的校準(zhǔn)曲線，按照以下公式擬合得到比例常數(shù)α₉：

在線性區(qū)間:

[ATP]＝α₉FATP，

[ATP]表示ATP的濃度；F_ATP為與[ATP]對應(yīng)的穩(wěn)態(tài)時(shí)測試樣品池?zé)晒鈴?qiáng)度減去對照樣品池的熒光強(qiáng)度；

所述熒光強(qiáng)度時(shí)間曲線在起始點(diǎn)的導(dǎo)數(shù)即可換算成該P(yáng)Pi濃度對應(yīng)的反應(yīng)速率：