[發明專利]實現兩個基因等量表達的基于2A裂解肽的多基因元件及表達載體和應用

有效

• 申請號: 201810348861.7
• 申請日: 2018-04-18
• 公開（公告）號: CN108486113B
• 公開（公告）日: 2021-04-23
• 發明（設計）人: 王峰;夏慶友;王元成;王日遠;陳文靜;趙萍
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85
• 代理公司: 重慶航圖知識產權代理事務所(普通合伙) 50247
• 代理人: 王貴君

本發明涉及實現兩個基因等量表達的基于2A裂解肽的多基因元件及表達載體和應用，所述基因元件由Ck與2A裂解肽組成；所述2A裂解肽核苷酸序列如SEQ ID NO.38；所述Ck的核苷酸序列SEQ ID NO.39所示，含有該元件的載體能夠等量地重組表達位于2A兩端的基因，對實現家蠶多基因表達具有重要意義。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及實現兩個基因等量表達的基于2A裂解肽的多基因元件，還涉及包含該元件的表達載體和應用。

背景技術

在家蠶體內高效地重組表達多個基因可以推動家蠶的基礎與應用研究，例如研究多個基因之間的相互關系、重組表達多亞基蛋白復合物的基因、與熒光蛋白同時表達可視化地研究靶標基因在體內的移動以及培育能夠抗家蠶質型多角體病毒與核型多角體病毒的家蠶品種等。得益于2000年家蠶轉基因操作體系的建立，此前，在家蠶體內同時表達多個基因主要是通過遺傳雜交來實現的。首先，必須先建立多個單一表達靶標基因的轉基因家蠶品系，再雜交，最后在雜交后代中篩選同時表達多個外源基因的家蠶個體。例如2006年，Takahiro Adachi等人成功將家蠶脯酰羥基酶β-亞基與人膠原蛋白同時表達在家蠶后部絲腺；2009年，MasashiIizuka等人同時表達了鼠單克隆抗體的輕鏈基因與重鏈基因，將完整的鼠單克隆抗體表達在了家蠶繭殼；2015年，Minoru Tada等人還利用Gal4/UAS系統，采用兩輪雜交的方式在家蠶中部絲腺中重組表達了anti-CD20單克隆抗體。該方法不僅耗時長，而且雜交過程比較繁瑣。

2A裂解肽是一個在1991年于口蹄疫病毒中發現的、存在于兩個蛋白(2A、2B)之間的寡肽，通常還有19-22個氨基酸。當核糖體到達2A的C端最后兩個氨基酸甘氨酸與脯氨酸時，由于核糖體酰胺中心內部結構的改變導致無法翻譯下游基因，此時，上游初生肽被水解釋放出核糖體，然后核糖體再翻譯下游基因，理論上可以實現兩個基因的等量表達。目前，2A已經在多個細胞系、物種(小鼠，斑馬魚，豬，果蠅和羊種)中成功共表達了多個基因組合，應用于治療癌癥和其他疾病，或遺傳改良具有特定功能或抗性植物和動物新品種。因此，前期研究中，我們也利用來至于豬腸病毒的P2A構建了家蠶絲腺2A多基因表達系統，但是，該系統并不能等量地重組表達位于2A上下游的DsRed基因與EGFP基因。

Kozak序列(Kozak consensus sequence)是位于真核生物mRNA 5’端帽子結構后面的一段核酸序列，通常是GCCACCAUGG，它可以與翻譯起始因子結合而介導含有5’帽子結構的mRNA翻譯起始。1981年，女科學家KOZAK在研究真核生物中起始密碼子AUG周邊堿基定點突變后對靶標基因的轉錄和翻譯所造成的影響時，首先總結出在真核生物中，起始密碼子兩端序列為：-G/N-C/N-C/N-ANNAUGG-，如GCCACCAUGG、GCCAUGAUGG時，轉錄和翻譯效率最高，特別是-3位的A、+4位的G對翻譯效率非常重要。目前，諸多研究者也相繼報道Kozak序列可以影響基因的表達水平。例如，2014年，通過將WNT16基因上游的調節序列(GCACCC)優化成為kozak序列(GCCACC)后，其表達量被提高了3.7倍，另外，GATA4基因上游Kozak序列-6位的G突變成C后，GATA4基因的表達量就被嚴重下調。

但是將Kozak序列用于優化家蠶絲腺中2A多基因表達系統，使其能夠等量地重組表達位于2A兩端的基因未見報道。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供實現兩個基因等量表達的基于2A裂解肽的基因元件；本發明的目的之二在于提供含有所述基因元件的多基因表達載體；本發明的目的之三在于提供基因元件的應用。

為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案：

1.實現兩個基因等量表達的基于2A裂解肽的基因元件，所述基因元件由Ck與2A裂解肽組成；所述Ck的核苷酸序列SEQ ID NO.39所示。