[發明專利]一種超聲波介導的秋水仙素加倍粳稻染色體的生產方法

有效

• 申請號: 201810348075.7
• 申請日: 2018-04-18
• 公開（公告）號: CN108617503B
• 公開（公告）日: 2021-10-01
• 發明（設計）人: 馬建;王云鵬;王寧寧;歷艷志;吳瑩;周洋;喬鈺
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: A01H1/08
• 分類號: A01H1/08
• 代理公司: 北京卓嵐智財知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11624
• 代理人: 任漱晨

1.一種超聲波介導的秋水仙素加倍粳稻染色體的生產方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、水稻種子的滅菌及萌動處理；

步驟2、采用超聲波輔助秋水仙堿處理水稻萌動種子，獲得染色體加倍的水稻苗；將制備好的露白水稻種子在無菌操作臺中，用鑷子轉移到含有超聲處理培養液I的三角瓶中，并鋁箔將三角瓶瓶身完全遮蓋，在冰水浴中孵育，隨即進行超聲波處理；完成上述處理后，將溶液去除，加入常溫的超聲處理培養液II超聲處理；處理后，用無菌水反復沖洗3-6次，最后用超聲處理培養液III處理水稻種子，然后，將種子用無菌水取出反復沖洗3-6次，并在篩選培養基I上進行光照培養，直到水稻幼苗表現為莖芽膨大，且略出現綠色；繼續培養12-15天，期間淘汰出現的白化苗和快速伸長的水稻苗；

所述的超聲處理培養液I的組成如下：KCl 0.75g，蔗糖35g，水解酪蛋白2g/L，脯氨酸1.72g，余量為水，pH5.8，以上體積總量為1L，超聲處理培養液I的用量與制備好的露白水稻種子的用量比為10:100-15:100ml/粒，添加超聲處理培養液I時的孵育時間為3-8min，超聲波處理功率為90-180W，處理方式為超聲處理5s，間隔5s，進行12組循環；超聲波發生探頭的直徑為10mm；超聲處理培養液II的組成如下：KCl 0.75g，蔗糖35g，水解酪蛋白2g/L，脯氨酸1.72g，秋水仙堿0.5g，余量為水，pH5.8，以上體積總量為1L，超聲處理培養液II的用量與制備好的露白水稻種子的用量比為10:100-20:100ml/粒，添加超聲處理培養液II時的超聲波處理功率為90-180W，處理方式為超聲處理5s，間隔5s，進行6組循環；超聲波發生探頭的直徑為10mm；超聲處理培養液III的組成如下：KCl 0.75g，秋水仙堿0.5g，余量為水，pH5.8，以上體積總量為1L；添加超聲處理培養液III時的處理時間為72h，期間每隔24h更換一次超聲處理培養液III；所述的篩選培養基I的組成如下：KCl 0.15g，瓊脂7.5g，余量為水，pH5.8，以上體積總量為1L；光照培養溫度為21-31℃；光照培養時間為20-28h；在篩選培養基I上繼續培養時間為12-15天；

步驟3、將步驟2得到的水稻苗轉移到篩選培養基II上繼續培養，直到幼苗逐漸生根完成即進行移栽；所述步驟3中的篩選培養基II的組成如下：KCl0.75g，瓊脂7.5g，余量為水，pH5.8，以上體積總量為1L；在篩選培養基II上繼續培養時間為12-15天。

2.根據權利要求1所述的生產方法，其特征在于，所述的步驟1中的水稻種子的滅菌及萌動處理具體按照以下步驟實施：

步驟1.1、精選水稻種子，在超凈工作臺中將其置于無菌三角瓶中；首先加入酒精，進行快速潤洗，隨后迅速將酒精倒出，并立即用無菌水沖洗3次；然后，向盛有水稻種子的三角瓶中加入H₂O₂浸泡，期間搖晃三角瓶幾次以便充分滅菌；最后，用無菌水反復沖洗水稻種子3-4次；

步驟1.2、向步驟1.1處理后的盛有水稻種子的三角瓶中加入赤霉素的無菌水溶液，用透氣的封口膜封口后，置于恒溫培養箱內避光培養，然后用無菌水清洗種子3次以上；隨后，向三角瓶中加入無菌水，繼續在恒溫培養箱內避光培養，直至種子露白。

3.根據權利要求2所述的生產方法，其特征在于，所述的水稻種子為吉農大878。

4.根據權利要求2所述的生產方法，其特征在于，所述步驟1.1中的酒精體積濃度為75％，酒精的用量與水稻種子的用量比例為10:100-20:100ml/粒，酒精的潤洗時間不超過40秒；H₂O₂的體積濃度為10％，H₂O₂的用量與水稻種子的用量比例為20:100-30:100ml/粒，H₂O₂的浸泡時間為10-20min。

5.根據權利要求2所述的生產方法，其特征在于，所述步驟1.2中的赤霉素的質量濃度為0.1％，赤霉素的用量與步驟1.1中無菌水處理后的水稻種子的用量的比例為10:100-20:100ml/粒，添加赤霉素的培養時間為10-15h，添加赤霉素的培養溫度為25-35℃；無菌水的用量為10:100-20:100ml/粒水稻種子，添加無菌水的培養溫度為25-35℃，添加無菌水的培養時間為8-36h。