[發明專利]一種堿性蛋白酶基因及其重組枯草芽孢桿菌菌株的構建方法

有效

• 申請號: 201810346766.3
• 申請日: 2018-04-18
• 公開（公告）號: CN108570477B
• 公開（公告）日: 2020-06-30
• 發明（設計）人: 劉丹妮
• 申請（專利權）人: 橫琴仲泰生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12N15/57
• 分類號: C12N15/57;C12N1/21;C12N15/75;C12N15/90;C12N15/56;C12N9/54;C12R1/125
• 代理公司: 廣州科沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 黃健儀

本發明涉及一種堿性蛋白酶基因及其重組枯草芽孢桿菌菌株的構建方法，屬于基因工程領域，本發明按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優化堿性蛋白酶BmP的基因序列得到Bmp?opt，同時通過基因敲除技術敲除了枯草芽孢桿菌168的堿性蛋白酶、中性蛋白酶以及中溫淀粉酶得到了突變菌株Bs1。將優化后的堿性蛋白酶基因Bmp?opt在突變菌Bs1進行表達，最終得到了高效表達堿性蛋白酶BmP的重組枯草芽孢菌株。

技術領域

本發明涉及一種堿性蛋白酶基因及其重組枯草芽孢桿菌菌株的構建方法，屬 于基因工程領域。

背景技術

蛋白酶是催化蛋白質水解的一類酶。根據蛋白酶的來源可分為動物性蛋白酶、 植物性蛋白酶以及微生物蛋白酶。相對于動物蛋白酶和植物蛋白酶，微生物來源 的蛋白酶作用范圍廣，水解底物種類多。微生物來源的蛋白酶根據其最適反應 pH環境可將蛋白酶分為酸性、中性和堿性蛋白酶。堿性蛋白酶是一類在堿性條 件下水解蛋白質的酶類，堿性蛋白酶因具有較強的水解能力，廣泛的應用于食品、 洗滌、飼料等工業領域。

目前制備堿性蛋白酶主要有兩種方式，一種是通過發酵培養產堿性蛋白酶的 野生菌從而獲得堿性蛋白酶；另一種是將堿性蛋白酶基因進行異源表達獲得堿性 蛋白酶。相對于模式菌，野生菌培養過程及培養基組成復雜，因此培養野生菌生 產堿性蛋白酶生產成本較高。相對于第一種方式，將堿性蛋白酶基因進行異源表 達能夠有效降低其生產成本。

中國專利申請201210563540.1公開了一種堿性蛋白酶及其重組表達工程菌， 其通過將克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)的堿性蛋白酶基因轉入枯草芽孢桿 菌(Bacillus subtilis)中，構建得到枯草芽孢桿菌工程菌株。該工程菌株能高效 表達堿性蛋白酶，20L罐發酵其酶活高達9120U/ml。本發明的重組表達堿性蛋 白酶可廣泛用作洗滌用品添加劑。該工程菌株由于堿性蛋白酶內基因的影響以及 基因序列適配性的影響表達活力較低。

發明內容

本發明首先對來源于莫海威芽孢桿菌(Bacillus mojavensis)堿性蛋白酶BmP 進行密碼子優化，同時通過基因敲除技術敲除了枯草芽孢桿菌168的堿性蛋白酶、 中性蛋白酶以及中溫淀粉酶得到了突變菌Bs1。將優化后的堿性蛋白酶基因 Bmp-opt在突變菌Bs1進行高效表達，最終得到了高效表達堿性蛋白酶BmP的 枯草芽孢菌株。

本發明根據枯草芽孢桿菌密碼子偏好性，對堿性蛋白酶基因Bmp(基因登錄 號：AY665611.1，序列如SEQ ID NO.1所示)進行優化得到堿性蛋白酶基因Bmp-opt，因此，本發明的目的之一是提供一種酶活高的堿性蛋白酶Bmp-opt基 因，其基因序列如SEQ ID NO.2所示。

為了減少枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶、中性蛋白酶以及中溫淀粉酶對重組堿性 蛋白酶BmP的影響，本發明敲除了枯草芽孢桿菌168的堿性蛋白酶基因、中性 蛋白酶基因和中溫淀粉酶基因，得到了突變菌株Bs1。故本發明目的之二是提供 一種用于表達堿性蛋白酶Bmp-opt基因的重組枯草芽孢桿菌菌株Bs1，所述的重 組枯草芽孢桿菌菌株的堿性蛋白酶基因、中性蛋白酶基因和中溫淀粉酶基因被敲 除。