[發(fā)明專利]一種生物樣品中細(xì)胞微囊泡的分離方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810343891.9
• 申請日: 2018-04-17
• 公開（公告）號: CN108546671A
• 公開（公告）日: 2018-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周明;范松;李勁松
• 申請（專利權(quán)）人: 馬英淙;周明;李勁松;范松
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京超凡志成知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11371
• 代理人: 蔡苗

本發(fā)明提供了一種生物樣品中細(xì)胞微囊泡的分離方法，屬于生物分析領(lǐng)域。這種分離方法包括：將預(yù)處理后的生物樣品與脂質(zhì)顆粒混合孵育后，形成細(xì)胞微囊泡?脂質(zhì)顆粒的復(fù)合物或融合物；再將細(xì)胞微囊泡?脂質(zhì)顆粒的復(fù)合物或融合物從生物樣品中分離。該方法使用脂質(zhì)顆粒捕獲細(xì)胞微囊泡，克服了現(xiàn)有的脂質(zhì)探針捕獲法在分離細(xì)胞微囊泡時脂質(zhì)分子在生物樣品溶液中分散性差、易組裝的缺陷，有效提高了細(xì)胞微囊泡的分離效率和純度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物分析領(lǐng)域，具體而言，涉及一種生物樣品中細(xì)胞微囊泡的分離方法。

背景技術(shù)

研究人員發(fā)現(xiàn)，在許多液體生物樣品中均含有多種膜包被的微囊泡，這類微囊泡內(nèi)包含信使RNAs和microRNA等核酸類物質(zhì)以及多種蛋白質(zhì)。以外泌體為例，研究證實，外泌體可作為信使，通過血液、尿液、乳液、唾液等途徑介導(dǎo)細(xì)胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其內(nèi)攜帶各種蛋白、核酸，甚至全基因組的DNA，因而外泌體內(nèi)容物通常可以反映細(xì)胞健康或者疾病的狀態(tài)，并且對周圍細(xì)胞產(chǎn)生的影響，其在一定程度上反映了腫瘤等疾病的相關(guān)信息。由此，有效分離此類細(xì)胞微囊泡具有重要意義。

目前，分離此類細(xì)胞微囊泡的方法主要有：1)超速離心法，這種方法需要采用昂貴的設(shè)備才能實現(xiàn)；2)聚合物沉淀法，其缺點在于所獲得的雜蛋白過多，影響純化過程；3)凝膠排阻法，其缺點在于分離效率低，產(chǎn)品純度不高；4)脂質(zhì)探針捕獲法，該方法是使用偶聯(lián)生物素的脂質(zhì)分子與樣品接觸，脂質(zhì)分子插入微囊泡的磷脂雙分子層中，再用親和素偶聯(lián)的磁珠捕獲生物素-脂質(zhì)分子-微囊泡復(fù)合物。該方法的缺點是脂質(zhì)分子在水溶液中分散性差，易自組裝成脂質(zhì)體。該方法的改進型是將脂質(zhì)分子通過硅烷化修飾在玻璃基底上，缺點是硅烷化的效率有限，玻璃基底的表面積有限；5)正電膜捕獲法，該方法是使用帶正電的再生纖維素多孔膜、以及帶正電的強陰離子交換樹脂，捕獲帶負(fù)電的微囊泡，其缺點是純度和分離效率有限。

由上述分析可知，現(xiàn)有技術(shù)中分離細(xì)胞微囊泡的技術(shù)都各有局限性，無法滿足研究需要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種生物樣品中細(xì)胞微囊泡的分離方法，旨在提高細(xì)胞微囊泡的分離效率和純度。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

一種生物樣品中細(xì)胞微囊泡的分離方法，其包括：

將預(yù)處理后的生物樣品與脂質(zhì)顆粒混合孵育后，形成細(xì)胞微囊泡-脂質(zhì)顆粒的復(fù)合物或融合物；再將細(xì)胞微囊泡-脂質(zhì)顆粒的復(fù)合物或融合物從生物樣品中分離。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果例如包括：

本發(fā)明提供的這種生物樣品中細(xì)胞微囊泡的分離方法，通過對生物樣品進行預(yù)處理，去除生物樣品中的細(xì)胞、細(xì)胞碎片以及團聚物，得到包含有細(xì)胞微囊泡的生物樣品上清液；再將該生物樣品上清液與脂質(zhì)顆粒混合孵育，在孵育過程中，由于脂質(zhì)顆粒的表面具有親脂性的基團或表面具有正電荷，其能夠通過親和作用與上清液中的細(xì)胞微囊泡結(jié)合、或者與上清液中的細(xì)胞微囊泡相融合，形成細(xì)胞微囊泡-脂質(zhì)顆粒的復(fù)合物或融合物；由于這種細(xì)胞微囊泡-脂質(zhì)顆粒的復(fù)合物或融合物的質(zhì)量及分子大小均遠(yuǎn)大于細(xì)胞微囊泡，故可利用較為常規(guī)的分離技術(shù)，便可使細(xì)胞微囊泡-脂質(zhì)顆粒的復(fù)合物或融合物與上清液分離，得到攜帶有細(xì)胞微囊泡的復(fù)合物或融合物；可進一步將其裂解，從中提取核酸或蛋白質(zhì)，用于多種生物分析中。

該方法使用脂質(zhì)顆粒捕獲細(xì)胞微囊泡，克服了現(xiàn)有的脂質(zhì)探針捕獲法在分離細(xì)胞微囊泡時脂質(zhì)分子在生物樣品溶液中分散性差、易組裝的缺陷，有效提高了細(xì)胞微囊泡的分離效率和純度。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，以下將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1為實施例1所得細(xì)胞外囊泡的蛋白與標(biāo)準(zhǔn)超速離心法所得的細(xì)胞外囊泡的蛋白，同時進行Western blot分析，得到的細(xì)胞外囊泡標(biāo)志物含量的結(jié)果。