[發(fā)明專利]一種組裝型細胞衍生細胞外基質(zhì)膜復(fù)合骨修復(fù)材料及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810343820.9
• 申請日: 2018-04-17
• 公開（公告）號: CN108310467B
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉紹愷;汪振星;孫家明;牟珊;陳靂風(fēng);周牧冉;曾宇陽;李嘉倫;周楚超;羅超;黎媛;侯金飛;方慧敏
• 申請（專利權(quán)）人: 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院
• 主分類號: A61L27/36
• 分類號: A61L27/36;A61L27/24;A61L27/20;A61L27/50;A61L27/56;A61L27/58
• 代理公司: 武漢楚天專利事務(wù)所 42113
• 代理人: 楊宣仙

1.一種組裝型細胞衍生細胞外基質(zhì)膜復(fù)合骨修復(fù)材料的制備方法，其特征在于具體步驟如下：

（1）脫細胞基質(zhì)膜（ECM膜）的制備：

a.將種子細胞種植于培養(yǎng)皿中，加入條件培養(yǎng)基或成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)至細胞外基質(zhì)分泌并鋪滿皿底；其中所述種子細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞、脂肪干細胞、成纖維細胞、成骨細胞中的任意一種；

b.在步驟a中細胞外基質(zhì)培養(yǎng)好之后，取出細胞培養(yǎng)皿，棄去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖（PBS）液輕柔沖洗2～3遍，然后往細胞培養(yǎng)皿中加入質(zhì)量百分比為0.1%~10%的去污劑在36~38 °C下處理60~120min溶解細胞膜及核膜之后，再次使用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2～3遍；

c.在步驟b中沖洗完成之后，再往細胞培養(yǎng)皿中加入脫氧核糖核苷酸酶質(zhì)量百分比為0.5%~1%、核糖核酸酶質(zhì)量百分比為0.05%~0.1%的PBS溶液在36~38 °C下處理2～3小時分解產(chǎn)物中殘留的核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸鏈；最后用磷酸鹽緩沖（PBS）液輕柔沖洗2～3遍，即得脫細胞基質(zhì)膜；

（2）多孔三維支架材料的制備：利用天然聚合物制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1～5 wt％的均質(zhì)凝膠溶液，然后加入凝膠溶液質(zhì)量百分比為0%~50%的交聯(lián)劑交聯(lián)8～24h，交聯(lián)完成后放入-20℃～ -40℃的低溫冰箱中預(yù)凍4～24h，最后通過冷凍干燥后形成三維多孔支架；其中所述天然聚合物包括膠原蛋白、明膠、纖維素、海藻酸鹽、透明質(zhì)酸、水溶性殼聚糖、絲素蛋白中的任意一種或多種；所述溶劑為水或濃度0.01%~1%的乙酸溶液；

（3）將步驟（1）中制備的ECM膜在培養(yǎng)皿中展開至平鋪于皿底，然后將步驟（2）制備的三維多孔支架進行環(huán)氧乙烷消毒后放入ECM膜中央，并在無菌環(huán)境下使用ECM膜將三維多孔支架完全包覆；其中所述ECM膜的面積為三維多孔支架表面積的3～10倍；

（4）將包覆有ECM膜的三維多孔支架置入-20～-80℃的條件下冷凍24h-48h后，采用冷凍干燥法干燥得到ECM膜復(fù)合骨修復(fù)材料。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組裝型細胞衍生細胞外基質(zhì)膜復(fù)合骨修復(fù)材料的制備方法，其特征在于：所述步驟（1）的步驟a中，種子細胞培養(yǎng)的條件為溫度36.5~37.5°C、CO2水平4.5~5.5%、pH值7.2-7.4的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～28天。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組裝型細胞衍生細胞外基質(zhì)膜復(fù)合骨修復(fù)材料的制備方法，其特征在于所述步驟（1）的步驟a中條件培養(yǎng)基的配方為：DMEM質(zhì)量百分比80%～90%、小牛血清質(zhì)量百分比10%～20%、青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL，L-抗壞血酸20~100 ug/mL；所述成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：DMEM質(zhì)量百分比80%～90%、小牛血清質(zhì)量百分比10%～20%、青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL，L-抗壞血酸20~100 ug/mL, β-磷酸甘油10mmol/L、地塞米松100nmol/L。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組裝型細胞衍生細胞外基質(zhì)膜復(fù)合骨修復(fù)材料的制備方法，其特征在于：所述步驟（1）的步驟b中的去污劑包括Triton X-100，十二烷基硫酸鈉，3-[7] -1-丙磺酸，Tween20中的任意一種或幾種混合。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組裝型細胞衍生細胞外基質(zhì)膜復(fù)合骨修復(fù)材料的制備方法，其特征在于所述步驟（1）的步驟c中含有脫氧核糖核苷酸酶和核糖核酸酶的PBS溶液具體是在PBS溶液中添加0.1~ 1mg/ml的脫氧核糖核苷酸酶，0.001~0.1 mg/ml 的核糖核酸酶，50~100 mmol/L Tris-HCl，1~100 mmol/L MgCl₂。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組裝型細胞衍生細胞外基質(zhì)膜復(fù)合骨修復(fù)材料的制備方法，其特征在于：所述步驟（2）中的交聯(lián)劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%~50%碳二亞胺，京尼平，戊二醛，鈣離子中的任意一種。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組裝型細胞衍生細胞外基質(zhì)膜復(fù)合骨修復(fù)材料的制備方法，其特征在于所上步驟（2）和步驟（4）中的冷凍干燥溫度為-40℃~-50℃，干燥時間為3~24h。