[發(fā)明專利]一種提高比活力的堿性蛋白酶BmP突變體及其編碼基因

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810343751.1
• 申請日: 2018-04-17
• 公開（公告）號: CN108570461B
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉丹妮
• 申請（專利權(quán)）人: 橫琴仲泰生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號: C12N9/50
• 分類號: C12N9/50;C12N15/57;C12N15/75;C12N1/21
• 代理公司: 廣州科沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 黃健儀

1.一種提高比活力的堿性蛋白酶BmP突變體，其特征在于，所述突變體為氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的蛋白酶BmP的突變體，其中突變位點為第236位和293位，所述的突變體包括4個組合突變體，分別命名為P2、P3、P8和P9，其中P2包含的突變位點為N236G和N293K；P3包含的突變位點為N236G和N293M；P8包含的突變位點為N236D和N293K；P9包含的突變位點為N236D和N293M。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高比活力的堿性蛋白酶BmP突變體，其特征在于，所述的堿性蛋白酶BmP突變體P2、P3、P8和P9的氨基酸序列分別如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQID NO.19和SEQ ID NO.20所示。

3.一種編碼權(quán)利要求1所述提高比活的堿性蛋白酶BmP突變體的基因，其特征在于，所述堿性蛋白酶BmP突變體P2、P3、P8和P9的編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

4.一種獲得權(quán)利要求1-2任一所述提高比活力的堿性蛋白酶BmP突變體的方法，其包括如下步驟：

1)堿性蛋白酶BmP基因合成及克隆：根據(jù)莫海威芽孢桿菌堿性蛋白酶基因序列直接合成目的基因，然后以目的基因為模板進行PCR擴增，將擴增得到的片段克隆到載體phyP43L，得到表達載體phyP43L-BmP；2)定點飽和突變：以構(gòu)建好的phyP43L-BmP載體為模板進行PCR擴增；將擴增好的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳并純化回收PCR產(chǎn)物；用限制性內(nèi)切酶DpnI將原始質(zhì)粒分解，將分解完的產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top10，通過菌液PCR驗證重組轉(zhuǎn)化子，提取驗證正確轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒進行測序，從而確定相應(yīng)的突變體；將測序正確的突變體，通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌WB600。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的突變方法，其特征在于，所述步驟1)中PCR擴增引物為：

R：5'-ATCGGGATCCGCTCAACCGGCGAAAAATGTT-3'；

F：5'-TCTAGCGGCCGC TTATTGAGCGGCAGCTTCGAC-3'。

6.一種包含權(quán)利要求3所述基因的重組載體。

7.一種包含權(quán)利要求3所述基因的宿主細胞。

8.一種權(quán)利要求1所述提高比活的堿性蛋白酶BmP突變體在飼料加工、釀造、洗滌或食品加工領(lǐng)域的應(yīng)用。