[發明專利]一種促進人多能干細胞定向分化為成熟神經元的方法

在審

• 申請號: 201810342643.2
• 申請日: 2018-04-17
• 公開（公告）號: CN108486058A
• 公開（公告）日: 2018-09-04
• 發明（設計）人: 劉妍;胡瑤;袁方;方愷恒;曹詩穎;徐敏
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793;C12N5/0735;C12N5/10
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

1.一種促進人多能干細胞定向分化為成熟神經元的方法，其特征在于，它包括如下步驟：

(1)使用E8培養液培養人多能干細胞至細胞增殖為60～80％的密度；

(2)將步驟(1)中得到的人多能干細胞用酶消化后，當天更換培養液為NIM培養液，此時為細胞分化的第0天；

(3)細胞分化的第7天，向步驟(2)中所得混合體系中加入胎牛血清，并將細胞貼壁培養；4～12小時后更換NIM培養液；

(4)細胞分化的第7～15天，每隔12～72h更換步驟(3)中所得體系中的NIM培養液；分化第16天，將形成的類神經管結構吹下，繼續用NIM培養液懸浮培養；

(5)細胞分化的第18天，在步驟(4)中所得的混合體系中用促神經成熟培養液替換NIM培養液；細胞分化的第18～23天，每隔12～72h更換促神經成熟培養液；

(6)細胞分化的第23天，將步驟(5)中所得細胞貼壁培養，培養液替換為含B27細胞培養添加劑的促神經成熟培養液；

(7)細胞分化的第26天，更換步驟(6)中所得混合體的培養基為NDM培養基，第26天后可觀察到成熟神經元的形成。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的酶為Dispase酶，濃度為0.5～5Uml^-1。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的消化是指在37℃，5v/v％的孵箱中1～2分鐘。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)～(5)中，所述的NIM培養液由DMEM/F12、NEAA和N2以90～99：0.5～5：0.5～5的體積比配制而成。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)～(6)中，所述的促神經培養液由步驟(2)～(5)所述的NIM培養液中加入鏈終止胸苷類似物AZT、BDNF和cAMP制備而成；其中，AZT的濃度為1～500μmol/L，BDNF的濃度為1～100ng/mL，cAMP的濃度為0.5～10μmol/L。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(6)中，所述的含B27細胞培養添加劑的促神經成熟培養液中，B27細胞培養添加劑和促神經成熟培養液的體積比為0.5～5：95～99.5。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(7)中，所述的NDM培養基由如下方法配置得到：將Neurobasal medium、NEAA和N2以97～99：0.5～2：0.5～2的體積比混合后，再加入B27、BDNF和cAMP；其中，NDM培養基中，B27和NDM培養基的體積比為1：10～100，BDNF的濃度為1～100ng ml^-1，cAMP的濃度為0.5～10μmol/L。