[發(fā)明專利]簡便快速檢測尿素的微流控雙水相液滴流方法及其裝置

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810341217.7
• 申請日: 2018-04-17
• 公開（公告）號: CN108613973B
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孟濤;董鈺漫;孟世昕;孫鶴家;王垚磊
• 申請（專利權(quán)）人: 西南交通大學(xué)
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78
• 代理公司: 成都信博專利代理有限責(zé)任公司 51200
• 代理人: 舒啟龍

1.一種采用微流控雙水相液滴流裝置的簡便快速檢測尿素的方法，微流控雙水相液滴流裝置為：由按同一軸線設(shè)置的內(nèi)水相進料毛細管(100)和內(nèi)水相出料毛細管(500)以及外水相進料毛細管(300)構(gòu)成；內(nèi)水相進料毛細管(100)的左端為平口端，作為內(nèi)水相進料口(110)，右端為錐口端作為其出料口(200)，內(nèi)水相進料毛細管(100)從外水相進料毛細管(300)左端插入其內(nèi)腔；內(nèi)水相出料毛細管(500)的左端為錐口端，作為其進料口(400)，右端為平口端，作為其出料口(410)，內(nèi)水相出料毛細管(500)從外水相進料毛細管(300)右端插入其內(nèi)腔；內(nèi)水相注射器經(jīng)硅膠管與內(nèi)水相進料口(110)連接，外水相注射器經(jīng)硅膠管與外水相進料毛細管(300)的左端進料口連接，上述內(nèi)、外水相注射器分別固定在內(nèi)、外水相注射泵的泵伸縮桿的夾頭上，由注射泵提供推進動力；其特征是，所述內(nèi)水相進料毛細管(100)的錐口端內(nèi)徑＜內(nèi)水相出料毛細管(500)錐口端內(nèi)徑；所述內(nèi)、外水相注射器均為10mL注射器，內(nèi)水相注射泵的流速為1μL·min^-1，外水相注射泵的流速為10μL·min^-1；在微流控雙水相液滴流裝置中，利用兩相流體的剪切作用在錐形入口處產(chǎn)生10～30納升的雙水相液滴，液滴內(nèi)水相為包含有待測尿素樣品和中性紅指示劑的聚乙二醇溶液，外水相為包含有脲酶的葡聚糖溶液；尿素與脲酶在雙水相液滴內(nèi)和界面處發(fā)生酶促反應(yīng)，產(chǎn)物碳酸銨傾向于往液滴內(nèi)擴散，并使液滴呈現(xiàn)弱堿性，導(dǎo)致液滴內(nèi)的中性紅指示劑變色，根據(jù)變色程度判斷樣品中是否含有尿素以及分析含量的高低；液滴在10～20秒的時間內(nèi)流經(jīng)反應(yīng)管，由出口處的同軸具有錐形尖口的毛細管接收，即與含有脲酶的葡聚糖外水相溶液分離，完成檢測；該含酶的外水相溶液收集后，能循環(huán)反復(fù)參與檢測尿素的反應(yīng)；

具體步驟如下：

(1)溶液的配制：分別配制質(zhì)量分數(shù)分別為8％～12％的聚乙二醇水溶液和8％～12％的葡聚糖水溶液；在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器上充分混合后，靜置6小時待兩相平衡分相；上相為聚乙二醇溶液，下相為葡聚糖溶液；抽取上相，配制成含濃度為1mg·mL^-1中性紅指示劑的聚乙二醇溶液；抽取下相配制成含濃度為1mg·mL^-1脲酶的葡聚糖溶液；上述所用聚乙二醇分子量8kDa；葡聚糖分子量500kDa；

將待測樣品加入到上述制備好的含中性紅指示劑的聚乙二醇溶液中作為內(nèi)水相，裝入內(nèi)水相注射器中；用外水相注射器吸取上述制備的含脲酶的葡聚糖溶液；通過內(nèi)、外水相注射泵打入微流控雙水相液滴流裝置，內(nèi)、外水相流體在內(nèi)水相進料毛細管(100)的錐形端出料口(200)處相遇，內(nèi)水相流體被外水相流體剪切，使其形成10～30納升的液滴，該液滴內(nèi)和界面處發(fā)生酶促反應(yīng)，生成產(chǎn)物碳酸銨，碳酸銨使得液滴內(nèi)相呈現(xiàn)弱堿性，中性紅是一種弱堿性指示劑，中性時呈紅色，弱堿性時呈黃色；因此，含有中性紅指示劑的液滴在錐形出口與外水相流體相遇后，酶促反應(yīng)使得液滴變?yōu)辄S色，通過中性紅指示劑的變色程度從而檢測尿素含量；

指示劑中性紅的變色程度是通過軟件Image-Pro Plus 6.0來測量的：中性紅指示劑由紅變黃，每種顏色都由紅黃藍三原色組成，使用1200萬像素的攝像頭拍攝標記位置液滴的顯微鏡照片，通過Image-Pro Plus 6.0軟件對照片進行分析，得出液滴紅色的強度值，來對應(yīng)樣品中尿素濃度的相對大小；

所述分析檢測使用的脲酶能循環(huán)使用：該裝置中，樣品在液滴內(nèi)，脲酶在液滴外，液滴在10～20秒的時間內(nèi)流經(jīng)反應(yīng)管，通過出口處的同軸毛細管錐形尖口將脲酶和產(chǎn)物碳酸銨分開收集；利用上述裝置中內(nèi)水相收集毛細管與外水相進料毛細管之間環(huán)隙，回收含脲酶的葡聚糖溶液，循環(huán)反復(fù)使用。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述內(nèi)水相流量為1μL·min^-1，外水相流量為10μL·min^-1條件下，尿素濃度為50,5,0.5,0mg·mL^-1時，顏色強度值為分別為0.08，0.107，0.127，0.2264。