[發明專利]一種基于毛細管四色熒光電泳檢測和多重熒光PCR擴增的高通量棉花品種指紋庫構建方法

有效

• 申請號: 201810338628.0
• 申請日: 2018-04-16
• 公開（公告）號: CN108707650B
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發明（設計）人: 吳玉珍;匡猛;周大云;黃龍雨;單峰
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院棉花研究所
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C40B50/06
• 代理公司: 鄭州萬創知識產權代理有限公司 41135
• 代理人: 任彬

1.一種基于毛細管四色熒光電泳檢測和多重熒光PCR擴增的高通量棉花品種指紋庫構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將分布于棉花A亞組或D亞組全基因組26條染色體上的52對核心引物進行多重熒光PCR組合，其中每對核心引物標記有熒光染料，

所述核心引物的核苷酸序列如下所示：

所述52對核心引物的多重熒光PCR組合方式如下所示：

(2)提取棉花DNA作為待測樣品；

(3)使用步驟(1)中52對核心引物按照多重熒光PCR組合方式組合得到的5個組合分別對待測樣品進行pSSR-PCR擴增反應，得到PCR擴增產物；

(4)將步驟(3)中的PCR擴增產物進行毛細管四色熒光電泳檢測與數據分析。

2.根據權利要求1所述的基于毛細管四色熒光電泳檢測和多重熒光PCR擴增的高通量棉花品種指紋庫構建方法，其特征在于：所述52對核心引物分別取自棉花A亞組和棉花D亞組各26對。

3.根據權利要求1所述的基于毛細管四色熒光電泳檢測和多重熒光PCR擴增的高通量棉花品種指紋庫構建方法，其特征在于，步驟(2)中所述提取棉花DNA包括以下步驟：將去殼棉種粉碎后，加入SDS提取液，漩渦充分后，65℃水浴；加入體積比依次為25：24：1的酚、氯仿和異戊醇的混合液，混勻，離心；取上清，加入濃度為10mg/mL RNase，水浴；抽提后離心取上清，加入異丙醇，待DNA成團析出后，用乙醇洗滌DNA沉淀，加入TE或ddH2O充分溶解DNA，備用。

4.根據權利要求3所述的基于毛細管四色熒光電泳檢測和多重熒光PCR擴增的高通量棉花品種指紋庫構建方法，其特征在于，步驟(2)中所述提取棉花DNA包括以下步驟：將去殼棉種充分粉碎后，加入800μL SDS提取液，漩渦充分后，65℃水浴30min，間隔10min輕搖一次；加入等體積800μL體積比依次為25：24：1的酚、氯仿和異戊醇的混合液，混勻至不分層，10000rpm離心10min；取上清，加入濃度為10mg/mL的1μL RNase，37℃水浴30min；重復抽提一次后離心取上清，加入0.7倍體積異丙醇，待DNA成團析出后，70％乙醇洗滌DNA沉淀2次，加入200μL TE或ddH₂O充分溶解DNA，備用。

5.根據權利要求1所述的基于毛細管四色熒光電泳檢測和多重熒光PCR擴增的高通量棉花品種指紋庫構建方法，其特征在于，步驟(3)中各個組合所對應pSSR-PCR擴增反應的反應液包括對應組合所有引物、PCR Buffer緩沖液、dNTPs、DNA模板、Taq HS聚合酶以及ddH₂O。