[發明專利]一種納米抗體與人胎盤堿性磷酸酶的融合蛋白及應用

有效

• 申請號: 201810334611.8
• 申請日: 2018-04-14
• 公開（公告）號: CN108484779B
• 公開（公告）日: 2022-01-11
• 發明（設計）人: 宋海鵬;古一;王歡;于建立;黃琪;李飛;陳曉恒;劉原源
• 申請（專利權）人: 深圳市國創納米抗體技術有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N9/16;G01N33/574
• 代理公司: 北京市眾天律師事務所 11478
• 代理人: 李新軍

本發明公開了一種納米抗體與人胎盤堿性磷酸酶的融合蛋白，所述融合蛋白由納米抗體或其可變區片段與人胎盤堿性磷酸酶報告基因蛋白串聯而成，本發明還提供了所述融合蛋白在制備CEACAM5抗原免疫檢測試劑盒中的應用。該融合蛋白用于免疫標記技術的免疫檢測，保持了良好的酶和抗體的生物學活性，具有較高的檢測效率。

技術領域

本發明公開了一種融合蛋白及其免疫學應用，屬于多肽技術領域，更具體地，屬于免疫球蛋白技術領域。

背景技術

堿性磷酸酶(alkaline phosphatase或ALP)是廣泛分布于人體肝臟、骨骼、腸、腎和胎盤等組織經肝臟向膽外排出的一種酶，屬于同源二聚體蛋白，分子量為56KDa。ALP每個單體由449個氨基酸組成，完整的ALP分子呈現典型的α/β的拓撲結構，同時每個單體均具有一個活性中心，活性中心區域由Asp101-Ser102-Ala103三連體、Arg166、水分子、三個金屬離子及其配體氨基酸組成。ALP被phoA基因編碼，與很多分泌蛋白一樣，在細胞質內合成氨基末端帶有信號肽的單體前體，信號肽引導前體跨內膜運輸后被切除，同源二聚體形成。這種酶能催化核酸分子脫掉5'磷酸基團，從而使DNA或RNA片段的5'-P末端轉換成5'-OH末端。但它不是單一的酶，而是一組同功酶。目前已發現有ALP1、ALP2、ALP3、ALP4、ALP5與ALP6六種同功酶，其中第1、2、6種均來自肝臟，第3種來自骨細胞，第4種產生于胎盤及癌細胞，而第5種則來自小腸絨毛上皮與成纖維細胞。除來源于胎盤外所有哺乳動物的ALP同工酶都能被高精氨酸所抑制；除來源于腸和胎盤外所有的ALP同工酶都能被左旋咪唑所抑制；而除了來源于胎盤的ALP(PALP和SEAP)外，幾乎所有的ALP都能在65℃2小時即被滅活。

堿性磷酸酶的測定方法有很多種，我國曾應用較廣的為磷酸苯二鈉比色法，但現在應用較多的是連續檢測法。原理為以磷酸對硝基酚為底物，2-氨基-2-甲基-1-丙醇或二乙醇胺為磷酸酰基的受體。在堿性環境下，ALP催化4-NPP水解產生游離的對硝基酚，在堿性溶液中轉變成黃色。根據405nm處吸光度增高速率來計算ALP活性單位。ALP也是目前免疫診斷試劑產品最常用的標記酶之一。與辣根過氧化物酶(HRP)相比，ALP用作標記酶的優點是，穩定性高、靈敏度高，缺點是成本高，標記困難。

在研究中最常用的ALP包括細菌堿性磷酸酶(Bacterial alkaline phosphatase，來源于Escherichia coli C₄)、SAP(Shrimp alkaline phosphatase，來源于一種北極蝦)、小牛腸堿性磷酸酶(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase，CIAP)和胎盤堿性磷酸酶(Placental Alkaline Phosphatase，PLAP)四種。其中，由于SAP是四種堿性磷酸酶中最容易被滅活的，因此被常應用于分子生物學領域中，主要用作核酸的去磷酸化。因為DNA通常會在5'端結合磷酸基團，用SAP去磷酸化能防止DNA分子5'端與3'端連接，從而在后續步驟準備好之前讓DNA分子抑制處于線性化狀態。同樣的原理，該酶還可通過去磷酸化用作放射標記示蹤。除此之外，堿性磷酸酶還可被作為標記酶廣泛應用于酶聯免疫測定。以競爭法檢測小分子抗原為例，抗體先與固相載體結合，然后讓待測樣品與事先經ALP標記過的該抗原競爭地與抗體結合，洗去未反應的過量ALP-抗原，加入顯色底物，則可以通過與按梯度濃度變化的標準品繪出的標準曲線對比從而知道待測樣品中抗原的濃度。目前，絕大部分使用的為小牛腸堿性磷酸酶，主要原因在于其比活性高。市售的CIAP的比活性根據制造商、品級的不同而多種多樣。此外，基本骨架中包含1,2-二氧雜環丁烷或吖啶酮的CIAP可以使用各種高靈敏度發光基質，以提高免疫測定的靈敏度。

在傳統的免疫標記技術中，辣根過氧化物酶標記在蛋白的賴氨酸殘基位置。相對于常規的四鏈抗體的scFv而言，納米抗體在親和力方面與其對應的scFv相當，但在可溶性、穩定性、對聚集的抗性、可重折疊性、表達產率以及DNA操作、文庫構建和3-D結構測定的容易性方面超越scFv。將納米抗體用于傳統的免疫學檢測會極大提高檢測效率，因此納米抗體的檢測應用具有極大地市場前景。