[發明專利]地衣芽孢桿菌DW2ΔlrpC在桿菌肽生產中的應用

有效

• 申請號: 201810333617.3
• 申請日: 2018-04-13
• 公開（公告）號: CN108441508B
• 公開（公告）日: 2020-12-29
• 發明（設計）人: 陳守文;蔡冬波;朱江;李陽;朱杉;李俊輝;樓麗君;陳曉斌
• 申請（專利權）人: 綠康生化股份有限公司
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N15/90;C12N15/66;C12N15/31;C12N1/21;C12P21/04;C12R1/10
• 代理公司: 福州市鼓樓區鼎興專利代理事務所(普通合伙) 35217
• 代理人: 李向楠;楊慧娟

1.通過敲除lrpC基因構建得到的地衣芽孢桿菌（ Bacillus licheniformis ）DW2ΔlrpC在桿菌肽生產中的應用，所述地衣芽孢桿菌DW2ΔlrpC的具體構建方法包括以下步驟：

（1）以地衣芽孢桿菌DW2的基因組DNA為模板，PCR擴增出lrpC基因的上游同源臂和lrpC基因的下游同源臂；再利用重疊延伸PCR方法將lrpC基因的上游同源臂和lrpC基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A；

（2）采用限制性內切酶Xba I和Sac I對步驟（1）得到的融合基因序列A進行雙酶切，得到酶切基因序列A；

（3）準備質粒 T2(2)-ori，并采用限制性內切酶Xba I和Sac I對質粒T2(2)-ori進行雙酶切，得到酶切質粒T2(2)-ori；

（4）將步驟（2）得到的酶切基因序列A連接到步驟（3）得到的酶切質粒T2(2)-ori中，得到lrpC基因敲除質粒T2(2)-ori- lrpC；

（5）將lrpC基因敲除質粒T2(2)-ori-lrpC轉入地衣芽孢桿菌DW2中，經卡那霉素抗性篩選得到陽性轉化子，抽質粒進行菌落PCR驗證，將驗證成功的陽性轉化子在45℃條件下轉接培養數次后，進行菌落PCR檢測，得到lrpC基因的上游臂或lrpC基因的下游臂與地衣芽孢桿菌DW2基因組DNA產生單交換的陽性單交換結合子菌株；

（6）挑選lrpC基因的上游臂與地衣芽孢桿菌DW2基因組DNA產生單交換的陽性單交換結合子菌株與lrpC基因的下游臂與地衣芽孢桿菌DW2基因組DNA產生單交換的陽性單交換結合子菌株混合接種于37℃、不含有卡那霉素的培養基中經過數次轉接培養，PCR法篩選得到敲除lrpC基因的地衣芽孢桿菌DW2ΔlrpC；

其中，上述步驟中的地衣芽孢桿菌DW2均為于2011年10月12日保藏于位于武漢的中國典型培養物保藏中心、保藏編號為CCTCC NO：M2011344的地衣芽孢桿菌DW2；

所述地衣芽孢桿菌DW2的基因組DNA序列中的lrpC基因如SEQ ID NO.1所示。

2.根據權利要求1所述的通過敲除lrpC基因構建得到的地衣芽孢桿菌DW2ΔlrpC在桿菌肽生產中的應用，其特征在于，該應用步驟包括：A種子發酵，B生產發酵。

3.根據權利要求2所述的通過敲除lrpC基因構建得到的地衣芽孢桿菌DW2ΔlrpC在桿菌肽生產中的應用，其特征在于，所述種子發酵的培養基配方為：8-10g/L蛋白胨，3-6g/L酵母浸出粉，7-10g/L氯化鈉，pH 7.0 ~ 7.2。

4.根據權利要求2所述的通過敲除lrpC基因構建得到的地衣芽孢桿菌DW2ΔlrpC在桿菌肽生產中的應用，其特征在于，所述生產發酵的培養基配方為：80-100g/L豆粕；15-45g/L玉米淀粉；4-8 g/LCaCO₃和0.5-2 g/L (NH₄)₂SO₄。