[發(fā)明專利]一種黑果枸杞耐鹽突變體的離體篩選方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810332231.0
• 申請日: 2018-04-13
• 公開（公告）號: CN108513910B
• 公開（公告）日: 2019-11-15
• 發(fā)明（設計）人: 王方琳;柴成武;王理德;尉秋實
• 申請（專利權）人: 甘肅省治沙研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01G7/06
• 代理公司: 11569 北京高沃律師事務所
• 代理人: 劉奇<國際申請>=<國際公布>=<進入國

1.一種黑果枸杞耐鹽突變體的離體篩選方法，包括以下步驟：

1)將NaCl溶液浸泡處理過的黑果枸杞種子接種于無菌苗培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，獲得無菌苗；

2)將所述無菌苗的葉片接種于含NaCl的胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基中進行愈傷組織培養(yǎng)，獲得胚性愈傷組織顆粒；

3)將所述胚性愈傷組織顆粒接種于NaCl脅迫不定芽誘導培養(yǎng)基中進行不定芽培養(yǎng)，獲得不定芽；

4)對所述不定芽進行NaCl脅迫培養(yǎng)，獲得預耐鹽不定芽；

5)對所述預耐鹽不定芽進行EMS誘變處理后篩選耐鹽不定芽；

6)將所述篩選得到的耐鹽不定芽進行生根培養(yǎng)，獲得黑果枸杞耐鹽試管苗；

步驟2)中所述的胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基為MS+NaCl+0.5~1.5mg/L 6-BA+0.2~0.8mg/L NAA+300~500mg/L脯氨酸+30~35g/L蔗糖；所述胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基的pH值為5.5~6.0；

步驟3)中所述的NaCl脅迫不定芽誘導培養(yǎng)基為MS+0.2~0.4mg/L 6-BA+1.0~2.0mg/L2,4-D+4.5~5.5g/L NaCl+28~32g/L蔗糖+4.5~5.0g/L瓊脂；所述NaCl脅迫不定芽誘導培養(yǎng)基的pH值為5.5~6.0；

步驟1)中所述的NaCl溶液浸泡處理包括兩輪高溫浸泡-低溫浸泡；所述高溫浸泡的溫度為38~42℃，所述高溫浸泡的時間為1.5~2.5h；所述低溫浸泡的溫度為12~17℃，所述低溫浸泡的時間為1.5~2.5h；

步驟2）中所述愈傷組織培養(yǎng)依次包括黑暗震蕩培養(yǎng)階段和光照靜置培養(yǎng)階段；所述黑暗震蕩培養(yǎng)階段的溫度為23~27℃；所述黑暗震蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為15~25rpm；所述黑暗震蕩培養(yǎng)的震蕩時間為6~10h/d；

步驟4）中所述NaCl脅迫培養(yǎng)獲得預耐鹽不定芽過程依次包括預耐鹽培養(yǎng)階段和預耐鹽篩選階段；所述預耐鹽培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基與步驟3)中所述的NaCl脅迫不定芽誘導培養(yǎng)基一致；所述預耐鹽篩選階段的培養(yǎng)基為MS+1.0~1.5mg/L KT+0.3~0.6mg/L NAA+28~32g/L蔗糖+4.5~5.0g/L瓊脂；

步驟5)中所述EMS誘變處理的EMS誘變液的濃度為3.5~4.5mg/L，所述EMS誘變處理的時間為8~10h；所述EMS誘變處理的轉(zhuǎn)速為8~12rpm；

步驟5）中篩選耐鹽不定芽的培養(yǎng)基為MS+0.45~0.55mg/L 6-BA+0.1~0.3mg/L IBA+4.5~5.5g/L NaCl+28~32g/L蔗糖+4.5~5.0g/L瓊脂。

2.根據(jù)權利要求1所述的離體篩選方法，其特征在于，步驟1)中所述的NaCl溶液的濃度為80~150mg/L。

3.根據(jù)權利要求1所述的離體篩選方法，其特征在于，步驟1)中所述的培養(yǎng)獲得無菌苗的過程包括依次進行的3~5d暗培養(yǎng)和2~10d光照培養(yǎng)。

4.根據(jù)權利要求1所述的離體篩選方法，其特征在于，所述黑暗震蕩培養(yǎng)的時間為6~8d；所述光照靜置培養(yǎng)的時間為6~8d。

5.根據(jù)權利要求1所述的離體篩選方法，其特征在于，所述愈傷組織培養(yǎng)在靜置培養(yǎng)階段后還包括梯度耐鹽培養(yǎng)；所述梯度耐鹽培養(yǎng)為每12~14d向所述胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基中添加NaCl。