[發明專利]一種DHAV-1 2C蛋白多克隆抗體、重組融合蛋白及其制備方法

在審

• 申請號: 201810331017.3
• 申請日: 2018-04-13
• 公開（公告）號: CN108586608A
• 公開（公告）日: 2018-09-28
• 發明（設計）人: 程安春;汪銘書;唐曉思;吳麗萍
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C12N15/70;C12N15/62;C07K19/00
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 夏艷

1.一種DHAV-12C蛋白多克隆抗體，其特征在于，其免疫原的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一種DHAV-12C蛋白多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、對DHAV-1X株病毒進行RNA提取并轉錄成cDNA，用設計的2C特異性引物DHAV-2C-P1和DHAV-2C-P2以DHAV-1的cDNA為模板進行2C片段的擴增；

步驟2、將正確擴增的2C片段連入pET32a上，成功構建pET32a-2C原核表達載體，將pET32a-2C轉入大腸桿菌Rossta(DE3)中，IPTG誘導后2C重組蛋白以不溶性性包涵體的形式表達，并進行Westernblot鑒定；

步驟3、純化2C重組蛋白，以2C重組蛋白作為免疫原免疫鼠獲得了2C蛋白的多克隆抗體，即為DHAV-12C蛋白多克隆抗體，該多克隆抗體的免疫原的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟1中的對DHAV-1X株病毒進行RNA提取具體為：將DHAV-1X株病毒用PBS稀釋，0.22μm微孔濾膜過濾，加雙抗，雙抗為青鏈霉素混合液，37℃水浴作用30min，接種于11日齡鴨胚的絨毛尿囊腔，0.2ml/枚，接種后于37℃孵化箱內孵育；棄24h內死亡的胚，收集24～72h內死亡的胚，收集尿囊液，-20℃保存備用。

4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟1中的2C特異性引物DHAV-2C-P1和DHAV-2C-P2的核苷酸序列分別為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

5.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟3中的純化2C蛋白具體為：

將成功轉化pET-32a-2C的Rossta表達菌大量誘導表達，加入裂解液重懸菌體，超聲破碎，每次1min，共3次，將超聲好的菌液12000r離心后取沉淀；用洗滌液洗滌沉淀，8000r離心5min，棄上清；重復用去離子水洗滌一次，將沉淀重懸于Tris-HCl中，12000g離心10min；沉淀用包涵體溶解液重懸，12000g離心10min，取上清；洗脫緩沖液含有較高濃度的尿素，用PBS溶液透析去除尿素；將透析袋剪成合適大小，置10mmol/L的NaHCO₃溶液中煮沸，蒸餾水漂洗，用10mmol/L的EDTA溶液煮沸，期間更換一次EDTA溶液，蒸餾水漂洗；用透析袋處理純化后的蛋白，平衡緩沖液4℃下進行透析直至咪唑完全去除；透析完畢，吸出蛋白質溶液-20℃保存；獲得目的蛋白，即為抗原。

6.一種MBP-2C重組融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。

7.一種MBP-2C重組融合蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：將麥芽糖結合蛋白(MBP)片段加在2C序列的N’端后連入pET-28a并轉入大腸桿菌Rossta(DE3)，IPTG誘導表達后并進行純化處理，制備得到可溶性的2C重組融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。

8.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述純化處理具體為：將Ni填料裝入層析柱中，使填料自然沉降；用過濾蒸餾水洗滌填料；用結合緩沖液平衡填料；將樣品上樣到柱子中，0.5ml/s；用結合緩沖液洗滌柱子；不同濃度的咪唑洗脫緩沖液冼脫結合的蛋白，分管搜集；SDS-PAGE分析蛋白的分布；將透析袋剪成合適大小，置10mmol/L的NaHCO₃溶液中煮沸，蒸餾水漂洗，用10mmol/L的EDTA溶液煮沸，期間更換一次EDTA溶液，蒸餾水漂洗；用透析袋處理純化后的蛋白，平衡緩沖液4℃下進行透析直至咪唑完全去除；透析完畢，吸出蛋白質溶液-20℃保存。

9.一種2C突變體，其特征在于，DHAV-12C蛋白上的第151位氨基酸由G變成氨基酸A、152位氨基酸由K變成氨基酸A、或151位氨基酸由G變成氨基酸A且152位氨基酸由K變成氨基酸A。