[發明專利]增強細胞的抗癌能力的方法及采用該方法獲得的增強型細胞

在審

• 申請號: 201810330186.5
• 申請日: 2018-04-13
• 公開（公告）號: CN108753817A
• 公開（公告）日: 2018-11-06
• 發明（設計）人: 孫博文;黃康華;彭吉潤
• 申請（專利權）人: 北京華偉康信生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C12N15/113;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 北京瑞恒信達知識產權代理事務所(普通合伙) 11382
• 代理人: 張偉

本發明提供一種增強CIK細胞的抗癌能力的方法，所述方法包括基于CRISPR/Cas9技術敲除CIK細胞的PD?1基因。本發明還提供采用該方法制得的增強型CIK細胞。實驗證明，敲除CIK細胞的PD?1基因能有效增強CIK細胞抗肝癌細胞能力，為腫瘤細胞免疫治療提供一種新的效應細胞。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，更具體而言，本發明涉及一種基于CRISPR/Cas9技術敲除CIK細胞的PD-1基因以增強CIK細胞的抗腫瘤能力的方法。

背景技術

肝細胞癌(HCC)是世界上癌癥相關死亡的最常見原因之一，居所有惡性腫瘤死亡率的第二位，其預后較差。目前傳統的肝癌治療主要涉及部分肝切除、肝移植、射頻消融(RFA)和經動脈化療栓塞。由于大部分病人明確診斷時病情已進入中晚期肝癌階段，目前傳統的治療方法難以為晚期患者提供臨床有效的益處。這也導致了肝癌的5年生存率一直保持在10-20％左右。

為了提高肝癌的存活率，學者們研究出了多種新型治療方案，其中過繼CIK細胞治療是其中有前景的治療之一。CIK細胞是由血液中人外周血單核細胞經體外擴增培養而產生的異質的細胞群，其細胞組成有CD4⁺T細胞、CD8⁺T細胞、CD3⁺CD56⁺細胞、NK細胞等，其中主要發揮抗腫瘤作用的是CD3⁺CD56⁺細胞，其可通過非MHC限制性、NK樣細胞殺死機制對腫瘤細胞起到殺傷作用。研究表明CIK細胞對多種腫瘤細胞具有殺傷作用，且對正常組織細胞無殺傷功能，這使CIK細胞在臨床上有廣闊的應用前景。目前已有多個CIK細胞臨床試驗正在開展中。例如，Lee團隊報道CIK細胞作為肝癌患者的輔助治療能明顯提高患者的中位生存期，降低腫瘤復發率。

但是，由于CIK細胞殺傷功能尚弱，臨床上常需要多次輸入大量CIK細胞或結合其他治療，這導致病人花費增加。另外有些病人因難以耐受多次輸注而中止治療，導致治療效果有限。因此近年來，許多研究集中在如何提高CIK細胞的能力上。例如，Schlimper將CIK細胞轉染針對CEA抗原的特異性嵌合受體來增強抗CEA⁺結腸癌細胞功能。Paola Iudicone報道白細胞介素-15可通過先天途徑增強CIK細胞對上皮癌細胞系的細胞毒性。而通過基因編輯手段給予CIK細胞進行相關基因敲除從而增強CIK細胞的抗腫瘤能力也逐漸受到學者重視。

PD-1，又名程序死亡因子1，是T細胞表面抑制性受體之一，主要表達于活化的T細胞，同時其也是T細胞耗竭的分子標志之一，在癌癥和慢性感染中，其表達上調。越來越多的證據表明，PD-1在體內和體外對CD8⁺T細胞的效應功能表現出負面影響。先前的研究已經報道了用抗體阻斷PD-1增加了腫瘤中的效應T細胞功能并且提高了抗腫瘤效果。

最近聚焦的定期間隔短回文重復序列(CRISPR)和CRISPR相關蛋白(Cas)(CRISPR-Cas9)系統成為用于基因編輯的有力工具。先前的研究表明，使用Cas9 RNP(Cas9：sgRNAribonucleoprotein)靶向單個基因顯著提高了Cas9介導的基因組靶向效率并降低了位點依賴性脫靶效應。然而對于非均質的CIK細胞，目前尚未見有文獻研究敲除PD-1后的CIK細胞的功能情況。

發明內容

本發明要解決的問題是，通過Cas9 RNP介導的敲除細胞毒T淋巴細胞或CIK細胞的PD-1基因能否增強細胞的抗腫瘤、特別是抗癌能力。本發明的發明人證實，通過電穿孔Cas9RNP進行的PD-1基因敲除在技術上是可行和高效的；此外，細胞毒T淋巴細胞或CIK細胞中的PD-1敲除增強了細胞對肝癌細胞系的細胞免疫應答和細胞毒性。

因此，本發明的一個目的是提供基于CRISPR/Cas9技術敲除細胞的PD-1基因以增強細胞的抗癌能力的方法，該方法中采用的靶向PD-1基因的sgRNA，以及獲得的增強型細胞。