[發明專利]一種腦組織冰凍切片的制備方法

在審

• 申請號: 201810330147.5
• 申請日: 2018-04-13
• 公開（公告）號: CN108572105A
• 公開（公告）日: 2018-09-25
• 發明（設計）人: 劉小菊;陳丹;李寧;張美芝;高杰;王梟宇;王海娟
• 申請（專利權）人: 山東中醫藥大學
• 主分類號: G01N1/42
• 分類號: G01N1/42;G01N1/30
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 張祥明

本發明公開了一種腦組織冰凍切片的制備方法，屬于生物學、醫學實驗領域，包括以下步驟：(1)組織取材及固定脫水：將動物腦組織進行固定和梯度脫水；(2)冷凍預處理：用PBS溶液沖洗腦組織并拭干，修平腦組織，用錫箔紙包裹，于冰凍切片機快速制冷區域冰凍后移出，等待處理；(3)半包埋處理：將腦組織進行半包埋處理，靜置1分鐘；(4)冰凍切片：將樣品托固定于切片機探頭上，作連續冠狀冰凍切片。(5)切片收集：將所需部位的切片收集于盛有冰凍保存液的6孔板內，切片于?20℃長期保存。本發明采用半包埋處理腦組織，可避免包埋劑對腦組織的影響，切片完整齊全，無冰晶形成，免疫熒光染色良好。

技術領域

本發明涉及一種腦組織切片方法，具體涉及一種腦組織冰凍切片的制備方法。屬于生物學、醫學實驗領域。

背景技術

冰凍切片是借助于低溫條件使組織達到一定的硬度然后切片的一種方法，能很好的保存組織的抗原和酶的活性，因而被廣泛應用于臨床快速病理診斷以及對于疾病的科學研究上。然而冰凍切片比石蠟切片要求高、難度大，而且冰凍切片、免疫熒光、免疫組化相較于臨床病理診斷，其對技術的要求更高。影響冰凍切片制作質量的主要因素有取材、切片時的溫度、包埋方式以及切片后的儲存。冷凍適宜的組織塊，適當的包埋方式，適當的切片，這樣才能切出完好的切片。此外，取材及切片過程中要不斷采取不同的措施用于避免冰晶的形成。

冰凍切片是免疫組織化學中最常用的切片方法。免疫熒光標記又是最常用的標記抗原的方法。目前，實驗室中冰凍切片的處理方法主要有兩種。方法一：動物處死后直接冰凍組織，利用OCT包埋后放于液氮液面冷凍至包埋劑中心即將變白時取出，然后立即放于-80℃冰箱保存備用切片。由于液氮的熔點低，利用液氮直接速凍的方法容易將組織凍裂；直接冰凍組織可能會影響組織形態的完整性；方法二：動物處死后立即切取組織塊，并快速投入固定液中固定，固定后再利用30％蔗糖溶液(0.1M PBS溶液)進行脫水，最后以組織塊沉下為準。

發明專利201310693067公開了一種腦組織快速冰凍切片的制備方法，利用經過丙酮作為冰凍包埋劑及液氮中間介質，使腦組織達到速凍的效果，在一定程度上減少冰晶的形成；發明專利201710568588公開了一種高爾基銀染神經組織的冰凍切片方法，采用含甘油10％～20％V/V、含蔗糖15％～20％W/V甘油-蔗糖混合溶液對銀染神經組織進行脫水處理，降低了神經組織的硬度和脆性，增強了其韌性。上述專利均采用包埋劑全包埋處理，雖然全包埋組織能夠很好的保護好組織形態，但是仍存在一定的缺陷，比如：固定、脫水不完全，切片后多采用直接貼片法進行后續免疫熒光染色，此方法可造成抗體的浪費及脫片、掉片等現象，且包埋劑全包埋易造成冰晶的形成。

發明內容

本發明的目的是為克服上述現有技術的不足，提供一種腦組織冰凍切片的制備方法。

為實現上述目的，本發明采用下述技術方案：

一種腦組織冰凍切片的制備方法，包括以下步驟：

(1)組織取材及固定脫水：使用心臟灌流取腦法取出動物腦組織，使用多聚甲醛進行固定，然后利用質量分數為10％、20％、30％蔗糖溶液進行梯度脫水；

(2)冷凍預處理：將冰凍切片機和樣品托提前預冷，用PBS溶液沖洗腦組織后用吸水紙拭干，修平腦組織，用錫箔紙包裹，放在冰凍切片機快速制冷區域冰凍，之后從快速制冷區域移出，等待處理；

(3)半包埋處理：在樣品托上淺涂一層包埋劑打底，包埋劑厚度為1mm，當包埋劑開始變白時，厚涂一層包埋劑，厚度為3mm將腦組織小心迅速放入包埋劑中，淺淺包裹腦組織底部，靜置1分鐘，上述操作均在冰凍切片機中進行；

(4)冰凍切片：將樣品托固定于切片機探頭上，作連續冠狀冰凍切片；

(5)切片收集：將所需部位的切片收集于盛有冰凍保存液的6孔板內，每孔依次放入切片，故每一部位均可收集6套切片，且每套切片的均一性良好，切片于-20℃長期保存。