[發明專利]復合微生物除臭劑的制備方法、除臭劑及其使用方法

有效

• 申請號: 201810327820.X
• 申請日: 2018-04-12
• 公開（公告）號: CN108310962B
• 公開（公告）日: 2020-10-20
• 發明（設計）人: 田丹;于景成;靳國良;丁雪梅;田藝偉;辛凱;韓光光
• 申請（專利權）人: 北京昊業同宇科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/16;B01D53/84;C12R1/01;C12R1/645;C12R1/23;C12R1/04;C12R1/07;C12R1/02
• 代理公司: 北京馳納智財知識產權代理事務所(普通合伙) 11367
• 代理人: 陳常美

1.一種復合微生物除臭劑的制備方法，其特征在于：它包括：以下步驟：

（一）環保酵素的制備

準備紅糖或糖蜜9kg、酵母膏1kg、水果或果皮20-30kg和純凈水100L；將紅糖或糖蜜和酵母膏在不高于40℃的溫開水溶化成糖水，水果或果皮用自來水清洗干凈，酵素發酵罐清洗干凈，并用60%～80%乙醇擦一遍酵素發酵罐；然后依次加入水果或果皮、上述糖水和純凈水，密封發酵罐自然發酵30～100天后；得到的環保酵素溶液中活菌總數為3.0×10¹⁰cfu/ml— 5.0×10¹⁰cfu/ml，PH為3.5～4；

（2）光合菌種子液的制備:

（a）光合菌在斜面培養基的培養

向3L的燒杯中依次加入乙酸鈉3.5g、氯化銨1g、氯化鎂0.1g、氯化鈣0.1g、磷酸二氫鉀0.4g、磷酸氫二鉀0.6g、酵母膏0.1g和純凈水800mL，攪拌溶解后煮沸加入瓊脂20g,充分攪拌使瓊脂溶解，然后用純凈水定容至1000mL，調節PH值至7±0.2；將配制好的培養基分裝至50ml的試管中，密封后放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在115℃～125℃條件下高壓12～16min；滅菌后將試管頭部枕在木條上，使管內培養基自然傾斜，凝固后即成斜面培養基；在無菌操作下，用無菌微量吸管，吸取50μL無菌水放入瓶中，再購買光合菌菌種放入上述瓶中搖勻，然后用接種環高密度地接種光合菌菌種于上述的斜面培養基上，在30～33℃條件下，活化18～24h，得到活化后的光合菌菌種；

(b) 光合菌在液體培養基的制備：

向3L的燒杯中依次加入乙酸鈉3g、氯化銨2g、氯化鈉0.1g、氯化鈣0.05g、磷酸二氫鉀0.5g、磷酸氫二鉀0.3g、硫酸鎂0.2g、硫酸錳0.02g、三氯化鐵0.002g和酵母膏0.1g,用純凈水溶解并定容至1000mL，調節PH值至6.5±0.2；將配制好的液體培養基分裝至250ml的錐形瓶中，密封后放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在115℃～125℃條件下高壓12～16min；將(a)活化后的光合菌菌種接種至(b)中液體培養基中培養，培養的液體稱為菌懸液,菌懸液在溫度34～38℃條件下，在100～150r/min搖床中培養40h～50h后，檢測各個菌懸液OD600的光密度，當各個菌懸液OD600的光密度等于或大于4.0時，停止培養，此時得到活菌數量為3.0×10⁸cfu/ml～4.0×10⁸cfu/ml的光合菌種子液；

（3）酵母菌種子液的制備

（c）酵母菌在斜面培養基的制備

向3L的燒杯中依次加入葡萄糖20g、酵母膏10g、蛋白胨20g和純凈水800mL，攪拌溶解后煮沸加入瓊脂20g，充分攪拌使瓊脂溶解，用純凈水定容至1000mL，調節PH值至6.5±0.2；將配制好的培養基分裝至50ml的試管中，密封后放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在115℃～125℃條件下高壓12～16min；滅菌后將試管頭部枕在木條上，使管內培養基自然傾斜，凝固后即成斜面培養基；在無菌操作下，用無菌微量吸管，吸取50μL無菌水放入瓶中，再購買酵母菌菌種放入上述瓶中搖勻，然后用接種環高密度地接種酵母菌菌種于上述的斜面培養基上，在30～33℃條件下，活化18～24h，得到活化后的酵母菌菌種；

(d) 酵母菌在液體培養基的制備

向3L的燒杯中依次加入葡萄糖9g、糖蜜45g、麩皮34～38g、玉米DDGS3g、棉籽粕2.75g、酵母膏0.75g、硫酸銨0.8g、磷酸二氫鉀3g、硫酸鎂0.3g和氯化鈣0.3g,用純凈水溶解并定容至1000mL,調節PH值至6.5±0.2；將配制好的液體培養基分裝至250ml的錐形瓶中，密封后放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在115℃～125℃條件下高壓12～16min；將(c)活化后的酵母菌菌種接種至(d)中液體培養基中培養，培養的液體稱為菌懸液,菌懸液在溫度34～38℃條件下，在100～150r/min搖床中培養40h～50h后，檢測各個菌懸液OD600的光密度，當各個菌懸液OD600的光密度等于或大于4.0時，停止培養，此時得到活菌數量為3.0×10⁸cfu/ml～4.0×10⁸cfu/ml的酵母菌種子液；

（4）乳酸菌種子液的制備

（e）乳酸菌在斜面培養基的制備：

向3L的燒杯中依次加入蛋白胨5g、玉米漿2g、蔗糖40g、乙酸鈉5g、氯化鈉10g、硫酸鎂5g和純凈水800mL,攪拌溶解后煮沸加入瓊脂20g,充分攪拌使瓊脂溶解，用純凈水定容至1000mL，調節PH值至7±0.2；將配制好的培養基分裝至50ml的試管中，密封后放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在115℃～125℃條件下高壓12～16min；滅菌后將試管頭部枕在木條上，使管內培養基自然傾斜，凝固后即成斜面培養基；在無菌操作下，用無菌微量吸管，吸取50μL無菌水放入瓶中，再購買乳酸菌菌種放入上述瓶中搖勻，然后分別用接種環高密度地接種乳酸菌菌種于上述的斜面培養基上，在30～33℃條件下，活化18～24h，得到活化后的乳酸菌菌種；

(f) 乳酸菌在液體培養基的制備

向3L的燒杯中依次加入蛋白胨10g、牛肉膏8g、酵母膏4g、檸檬酸氫二銨2g、葡萄糖20g、吐溫～801g、乙酸鈉5g、磷酸氫二鉀2g、硫酸鎂0.2g和硫酸錳0.04g，用純凈水溶解并定容至1000mL，調節PH值至6.0±0.2；將配制好的液體培養基分裝至250ml的錐形瓶中，密封后放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在115℃～125℃條件下高壓12～16min；將(e)活化后的乳酸菌菌種接種至(f)中液體培養基中培養，培養的液體稱為菌懸液,菌懸液在溫度34～38℃條件下，在100～150r/min搖床中培養40h～50h后，檢測各個菌懸液OD600的光密度，當各個菌懸液OD600的光密度等于或大于4.0時，停止培養，此時得到活菌數量為3.0×10⁸cfu/ml～4.0×10⁸cfu/ml的乳酸菌種子液；

（5）放線菌種子液的制備

（g）放線菌斜面培養基的制備：

向3L的燒杯中依次加入牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g和純凈水800mL,攪拌溶解后煮沸加入瓊脂15g，用純凈水容至1000mL,調節PH值至7.2±0.2；將配制好的培養基分裝至50ml的試管中，密封后放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在115℃～125℃條件下高壓12～16min；滅菌后將試管頭部枕在木條上，使管內培養基自然傾斜，凝固后即成斜面培養基；在無菌操作下，用無菌微量吸管，吸取50μL無菌水放入瓶中，再購買放線菌菌種放入上述瓶中搖勻，然后用接種環高密度地接種放線菌菌種于上述的斜面培養基上，在30～33℃條件下，活化18～24h，得到活化后的放線菌菌種；

（h）放線菌液體培養基的制備：

向3L的燒杯中依次加入葡萄糖10g、酵母膏4g、蛋白胨4g、磷酸氫二鉀4g、磷酸二氫鉀2g和硫酸鎂0.5g，用純凈水溶解并定容至1000mL，調節PH值至6.5±0.2；將配制好的液體培養基分裝至250ml的錐形瓶中，密封后放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在115℃～125℃條件下高壓12～16min；將(g)活化后的放線菌菌種接種至(h)中液體培養基中培養，培養的液體稱為菌懸液,菌懸液在溫度34～38℃條件下，在100～150r/min搖床中培養40h～50h后，檢測各個菌懸液OD600的光密度，當各個菌懸液OD600的光密度等于或大于4.0時，停止培養，此時得到活菌數量為3.0×10⁸cfu/ml～4.0×10⁸cfu/ml的放線菌種子液；

（5）芽孢桿菌種子液的制備

(i)芽孢桿菌斜面培養基的制備：

向3L的燒杯中依次加入蛋白胨10g、牛肉膏15g、氯化鈉15g和純凈水800mL,攪拌溶解后煮沸加入瓊脂18g，用純凈水定容至1000mL,調節PH值至7±0.2；將配制好的培養基分裝至50ml的試管中，密封后放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在115℃～125℃條件下高壓12～16min；滅菌后將試管頭部枕在木條上，使管內培養基自然傾斜，凝固后即成斜面培養基；在無菌操作下，用無菌微量吸管，吸取50μL無菌水放入瓶中，再購買芽孢桿菌菌種放入上述瓶中搖勻，然后用接種環高密度地接種芽孢桿菌種于上述的斜面培養基上，在30～33℃條件下，活化18～24h，得到活化后的芽孢桿菌菌種；

(j) 芽孢桿菌液體培養基的制備：

向3L的燒杯中依次加入玉米淀粉20g、玉米漿10g、硫酸銨5g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂1g和氯化鈉1g，用純凈水溶解并定容至1000mL，調節PH值至6.5±0.2；將配制好的液體培養基分裝至250ml的錐形瓶中，密封后放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在115℃～125℃條件下高壓12～16min；將(i)活化后的芽孢桿菌種接種至(j)中液體培養基中培養，培養的液體稱為菌懸液,菌懸液在溫度34～38℃條件下，在100～150r/min搖床中培養40h～50h后，檢測各個菌懸液OD600的光密度，當各個菌懸液OD600的光密度等于或大于4.0時，停止培養，此時得到活菌數量為3.0×10⁸cfu/ml～4.0×10⁸cfu/ml的芽孢桿菌種子液；

(6) 醋酸菌種子液的制備

（k）醋酸菌斜面培養基的制備：向3L的燒杯中依次加入葡萄糖10g、酵母粉10g、碳酸鈣10g和純凈水800mL,攪拌溶解后煮沸加入瓊脂25g，用純凈水定容至1000mL,調節PH值至6.5±0.2；將配制好的培養基分裝至50ml的試管中，密封后放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在115℃～125℃條件下高壓12～16min；滅菌后將試管頭部枕在木條上，使管內培養基自然傾斜，凝固后即成斜面培養基；在無菌操作下，用無菌微量吸管，吸取50μL無菌水放入瓶中，再購買醋酸菌菌種放入上述瓶中搖勻，然后用接種環高密度地接種醋酸菌菌種于上述的斜面培養基上，在30～33℃條件下，活化18～24h，得到活化后的醋酸菌菌種；

(l) 醋酸菌液體培養基的制備：

向3L的燒杯中依次加入葡萄糖10g、酵母粉10g和食用酒精10ml，用純凈水溶解并定容至1000mL，調節PH值至5.5±0.2；將配制好的液體培養基分裝至250ml的錐形瓶中，密封后放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在115℃～125℃條件下高壓12～16min；將(k)活化后的醋酸菌菌種接種至(l)中液體培養基中培養，培養的液體稱為菌懸液,菌懸液在溫度34～38℃條件下，在100r/min～150r/min搖床中培養40h～50h后，檢測各個菌懸液OD600的光密度，當各個菌懸液OD600的光密度等于或大于4.0時，停止培養，此時得到活菌數量為3.0×10⁸cfu/ml～4.0×10⁸cfu/ml的醋酸菌種子液；

（7）制備混合微生物發酵液

將1kg紅糖溶于9L蒸餾水中，制得紅糖培養基；分別取步驟（2）至(6)的20%～40%體積的光合菌種子液、10%～30%體積的酵母菌種子液、5%～15%體積的乳酸菌種子液、5%～15%體積的放線菌種子液、5%～15%體積的芽孢桿菌種子液和5%～15%體積的醋酸菌種子液混合成復合微生物接種至上述紅糖培養基中，在20～25℃條件下密封發酵7-10天，得到活菌數量為3.0×10¹⁰cfu/ml～4.0×10¹⁰cfu/ml的混合微生物發酵液；

（8）環保酵素和微生物發酵液的混合

將步驟（1）得到的環保酵素過濾后，按照體積比0.5～1: 1～1.5的比例，將上述環保酵素與步驟（7）得到的混合微生物發酵液混合均勻即得復合微生物除臭劑；所得到的復合微生物除臭劑中活菌總數為3.5×10¹⁰cfu/ml/ml～4.5×10¹⁰cfu/ml。