[發明專利]一種鴨傳染性漿膜炎微囊化口服疫苗的制備方法

在審

• 申請號: 201810324884.4
• 申請日: 2018-04-12
• 公開（公告）號: CN108210919A
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發明（設計）人: 李守軍;丁旭娜;王秋東;陳冰;郁宏偉;張立霞;李亞杰;劉海霞
• 申請（專利權）人: 天津瑞普生物技術股份有限公司;天津市濱海新區瑞普生物研究院
• 主分類號: A61K39/02
• 分類號: A61K39/02;A61K9/50;A61K47/38;A61K47/36;A61K47/02;A61P31/04
• 代理公司: 天津合正知識產權代理有限公司 12229
• 代理人: 陳松

1.一種鴨傳染性漿膜炎微囊化口服疫苗的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1)鴨傳染性漿膜炎菌液的制備；

2)取步驟1)所述菌液制備免疫用滅活抗原；

3)取步驟2)所述的滅活抗原按照比例加入保護劑制成芯材；

4)包材的制備；

5)取步驟3)所得產物，采用步驟4)所述的包材進行微囊化包被并分散到凍干保護劑中冷凍干燥制成疫苗。

2.根據權利要求1所述的一種鴨傳染性漿膜炎微囊化口服疫苗的制備方法，其特征在于步驟2)免疫用滅活抗原是以步驟1)所述的鴨傳染性漿膜炎菌液為抗原制備的。

3.根據權利要求1所述的一種鴨傳染性漿膜炎微囊化口服疫苗的制備方法，其特征在于步驟1)所述菌液的制備方法為：將凍干菌種用LB肉湯復溶后，挑取菌液在含2％-5％新生牛血清TSA平板上進行劃線復蘇，在37℃5％CO₂條件下或是在厭氧罐中培養20-24小時，挑取單菌落接種于TSA固體培養基上劃線培養16-20小時制備一級種子，將一級種子接種添加2％～5％新生牛血清的LB液體培養中振蕩培養10-14小時制備二級種子，并將二級種子按照2％-5％的接種比例接種添加1％～3％新生牛血清的LB液體培養基的發酵罐中發酵培養10-16小時收獲菌液。

4.根據權利要求1所述的一種鴨傳染性漿膜炎微囊化口服疫苗的制備方法，其特征在于步驟2)免疫用滅活抗原是將步驟1)制備的鴨傳染性漿膜炎菌液經離心濃縮后，加甲醛滅活；其中離心濃縮的轉速為5000～8000rpm，離心時間為15～30min，為5-10倍；滅活包括以下步驟：以1:200～1:500(w/w)的比例向濃縮后的鴨傳染性漿膜炎菌液中加入甲醛溶液，于37℃滅活18～96h。

5.根據權利要求1所述的一種鴨傳染性漿膜炎微囊化口服疫苗的制備方法，其特征在于步驟3)所述的保護劑成分包括蔗糖、脫脂乳、水解乳蛋白，海藻糖、甘氨酸、谷氨酸鈉；各組分比例如下蔗糖0.5～1％，脫脂乳1～2％、水解乳蛋白0.1％～0.5％、海藻糖0.2％～10％、甘氨酸0.1％～0.5％、谷氨酸鈉0.2％～0.5％。

6.根據權利要求1所述的一種鴨傳染性漿膜炎微囊化口服疫苗的制備方法，其特征在于步驟3)所述的保護劑配制方法為將蔗糖、脫脂乳、水解乳蛋白成分按照比例分別溶解后，115℃高壓滅菌20min；海藻糖、甘氨酸和谷氨酸鈉組分按照比例分別溶解后經0.22μm的濾膜進行過濾除菌。

7.根據權利要求1所述的一種鴨傳染性漿膜炎微囊化口服疫苗的制備方法，其特征在于步驟4)所述的包材選自海藻酸鈉，殼聚糖、乙基纖維素、氯化鈣；其中海藻酸鈉的濃度為2％～3％，殼聚糖的濃度為0.1％～0.5％，氯化鈣的濃度為2％～3％，乙基纖維素的濃度為5％～10％。

8.根據權利要求1所述的一種鴨傳染性漿膜炎微囊化口服疫苗的制備方法，其特征在于步驟5)所述的疫苗制備方法為：將檢驗合格的滅活抗原使用通過離心重懸方式使用保護劑重懸，再與海藻酸鈉攪拌混勻20分鐘～40分鐘制成乳濁液，采用噴霧的方法噴入氯化鈣溶液中，形成海藻酸鈣微膠囊，噴霧完畢后繼續攪拌20分鐘～30分鐘；離心收集海藻酸鈣微膠囊，然后將微膠囊分散到殼聚糖溶液中，充分攪拌20分鐘～40分鐘，離心收集海藻酸鈣-殼聚糖微膠囊，去離子水洗滌3次，再將收集的微膠囊分散到凍干保護劑中，混勻后經冷凍干燥進行脫水后制成微膠囊。

9.根據權利要求1所述的一種鴨傳染性漿膜炎微囊化口服疫苗的制備方法，其特征在于步驟5)所述的凍干保護劑成分包括海藻糖2％～10％，甘露醇5％～10％，山梨醇5％～10％、蔗糖5～10％、葡萄糖5％～10％當中的一種組分或多種組分。