[發明專利]一種同步檢測4種豬腹瀉性病毒的酶促可視化寡核苷酸芯片及其應用

有效

• 申請號: 201810322524.0
• 申請日: 2018-04-11
• 公開（公告）號: CN108531649B
• 公開（公告）日: 2022-03-22
• 發明（設計）人: 黃小波;文心田;曹三杰;劉志鵬;文翼平;趙勤;伍銳
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6837;C40B40/06;C12N15/11
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 張娟;劉華玲

本發明提供了一種同步檢測4種豬腹瀉性病毒的酶促可視化寡核苷酸芯片，包含固相載體和固定在該固相載體上的寡核苷酸探針，分別用于檢測豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬A群輪狀病毒和豬δ冠狀病毒。本發明還提供了一種上述芯片的制備方法。本發明還提供了同步檢測4種豬腹瀉性病毒的試劑盒及檢測方法。本發明將酶促反應和基因芯片技術相結合，能夠快速檢測和鑒別診斷四種豬腹瀉病毒病，特異性好，準確度高，且檢測結果肉眼可見，為豬病毒性腹瀉的防控提供一種新的診斷技術；而且本發明芯片的制備方法簡單、成本低，可應用于臨床疫病的大量檢測，為保障我國養豬業的健康發展提供技術支撐。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種同步檢測4種豬腹瀉性病毒的酶促可視化寡核苷酸芯片及其應用。

背景技術

近年來，豬傳染性腹瀉疾病的發生與流行日益嚴重，給廣大養殖戶造成了難以估量的經濟損失。目前在我國豬傳染性腹瀉疾病的病毒原主要是豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemic diarrhea virus,PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissiblegastroenteritis virus,TGEV)、豬A群輪狀病毒(Group A rotavirus，GAR)。這三類病毒所引起的疫病發生后外觀特征基本相似，均表現為嘔吐、水樣噴射腹瀉和脫水等，特別是哺乳仔豬發病嚴重且死亡率高。豬δ冠狀病毒(Porcine Deltacoronavirus，PDCoV)于2012年首次在香港被報道出有豬場發現該病毒，隨后于2014年在美國俄亥俄州和伊利諾伊州報道出有豬場發現該種病毒，此后至少有19個州都有該種病毒的報道。PDCoV主要感染整段小腸，尤其是空腸和回腸，引起嚴重的腸炎病伴隨有小豬的腹瀉和嘔吐。由于腹瀉病毒常常出現混合感染的情況，且臨床鑒別診斷較困難，開展四種豬腹瀉病毒的同步鑒別診斷對防控具有重要意義。

目前，針對病毒性疾病的診斷方法主要有病毒分離鑒定、血清學方法(免疫電鏡法、免疫組織化學、免疫熒光、酶聯免疫吸附試驗(ELISA))以及分子生物學檢測技術(原位雜交(ISH)、聚合酶鏈式反應(RT-PCR))等，這些方法雖然得到了一定的應用，但在診斷混合感染中仍然存在不足。例如病毒分離不易成功，血清學檢測靈敏性低，檢測過程中容易出現交叉反應，分子生物學檢測的樣本數量有限導致無法實現樣品高通量的快速檢測。而相比于傳統檢測方法，基因芯片技術作為一種新型的高通量檢測技術，具有操作簡單、準確性高、靈敏度強等常規方法無法比擬的優點，適合對多種病原的快速檢測。

可視化基因芯片是在常規基因芯片的原理上，根據各病毒的保守基因序列，利用生物軟件設計特異性探針，按照一定規律點樣在玻璃片或者膜片上，水合之后形成可以長期保存的芯片。在PCR引物的5’端引入生物素，在辣根過氧化物酶上引入鏈霉親和素，利用生物素-鏈霉親和素反應使酶和二氨基聯苯胺(DAB)特異性顯色反應而放大信號，形成肉眼可見的結果。該檢測平臺特異性好，高通量，靈敏度高，能應用于臨床樣品，更加適用于基礎實驗室及臨床檢測。它不僅有普通生物芯片高通量的特性，又有操作簡便、經濟實惠的特點，這使它在科研和臨床中有著廣泛的應用并為高通量分子鑒別診斷提供了新的良好平臺。

目前利用可視化基因芯片技術檢測豬腹瀉病毒的報道僅見本團隊馬銳前期研究等，豬病毒性腹瀉病金標銀染可視化芯片技術實驗條件優化研究及應用，農業生物技術學報，2016,24:1233-1242，該方法僅能檢測三種特定的豬腹瀉病毒；而且使用的可視化芯片是以玻片做固相載體，在制備時需要進行水合處理，該方法不僅成本高，且操作步驟復雜，耗時長。

發明內容

本發明的目的在于提供一種同步檢測4種豬腹瀉性病毒的酶促可視化寡核苷酸芯片及其應用。

本發明提供了一種同步檢測4種豬腹瀉性病毒的酶促可視化寡核苷酸芯片，包含固相載體和固定在該固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包含：SEQ ID NO：1-2所示探針、SEQ ID NO：3-4所示探針、SEQ ID NO：5-6所示探針、SEQ ID NO：7-8所示探針，分別用于檢測豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬A群輪狀病毒和豬δ冠狀病毒。