[發(fā)明專利]用于提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因表達(dá)的調(diào)控序列、表達(dá)載體、表達(dá)系統(tǒng)及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810316670.2
• 申請(qǐng)日: 2018-04-08
• 公開（公告）號(hào): CN110343699A
• 公開（公告）日: 2019-10-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王天云;賈巖龍;王穩(wěn);王小引;郭瀟;王燕芳;井長(zhǎng)勤;王芳;林艷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/85;C12N15/67
• 代理公司: 鄭州睿信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

本發(fā)明涉及用于提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因表達(dá)的調(diào)控序列、表達(dá)載體、表達(dá)系統(tǒng)及其應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明根據(jù)CMV啟動(dòng)子、增強(qiáng)子的序列特征，結(jié)合生物學(xué)信息及實(shí)驗(yàn)，發(fā)明了3種用于組合啟動(dòng)子的調(diào)控序列，分別為人CMV啟動(dòng)子核心序列(hCPE)、合成的調(diào)控元件(SEE)、人巨細(xì)胞病毒即早期增強(qiáng)子(hCMVE)，將這三種調(diào)控序列插入表達(dá)載體的啟動(dòng)子上游，可以驅(qū)動(dòng)外源基因高效、持續(xù)、穩(wěn)定表達(dá)。同等條件下，與不含上述調(diào)控序列的表達(dá)載體相比，本發(fā)明中表達(dá)載體能顯著提高外源基因的表達(dá)水平，可用于重組蛋白的生產(chǎn)等。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因表達(dá)的調(diào)控序列、表達(dá)載體、表達(dá)系統(tǒng)及其應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

基因工程是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，將重組表達(dá)載體導(dǎo)入到受體細(xì)胞中，進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)，生產(chǎn)出符合人類需要的產(chǎn)品或創(chuàng)造出生物的新性狀，并使之穩(wěn)定地遺傳給下一代。由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)由于能夠進(jìn)行重組蛋白正確的折疊和翻譯后修飾，對(duì)于復(fù)雜的重組蛋白，尤其是結(jié)構(gòu)復(fù)雜或糖基化的蛋白質(zhì)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是其蛋白表達(dá)的優(yōu)選系統(tǒng)。但哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)普遍存在表達(dá)水平較低，轉(zhuǎn)基因沉默(Transgene silencing)和轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平低下已成為基因工程產(chǎn)業(yè)亟待解決的關(guān)鍵問題。研究證實(shí)轉(zhuǎn)基因雖能夠整合到宿主的基因組中，且保留完整的拷貝，但是轉(zhuǎn)基因卻不能穩(wěn)定表達(dá)或表達(dá)水平低下，有時(shí)甚至完全被抑制。為提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和穩(wěn)定性，研究人員在克服轉(zhuǎn)基因沉默等方面進(jìn)行了許多有益的嘗試，比如在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)選用強(qiáng)啟動(dòng)子、使用增強(qiáng)子，或在轉(zhuǎn)基因操作時(shí)進(jìn)行去甲基化處理等。

其中利用組合啟動(dòng)子(Synthetic promoter)提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)是近年來發(fā)展起來的克服轉(zhuǎn)基因沉默、提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)的一種有效方法。組合啟動(dòng)子是調(diào)控元件和啟動(dòng)子的結(jié)合序列。將組合啟動(dòng)子整合到表達(dá)載體中能夠發(fā)揮表觀調(diào)控因子作用，并降低轉(zhuǎn)基因沉默。目前雖然有組合啟動(dòng)子的報(bào)道(Brown,A.J.,Sweeney,B.,Mainwaring,D.O.&James,D.C.Synthetic promoters for CHO cell engineering.Biotechnol.Bioeng.2014,111(8):1638–1647.Sladitschek,H.L.Neveu,P.A.Bidirectional Promoter Engineeringfor Single Cell MicroRNA Sensors in Embryonic Stem Cells.PLoS One.11,2016,e0155177)。但是這些組合啟動(dòng)子在提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平方面仍不盡理想，一是組合啟動(dòng)子序列較長(zhǎng)，二是轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平還有待提高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用于提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因表達(dá)的調(diào)控序列，該序列可有效提高重組CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平。

本發(fā)明還提供了包含上述調(diào)控序列的表達(dá)載體及其制備方法。

本發(fā)明還提供了包含上述表達(dá)載體的表達(dá)系統(tǒng)及其制備方法。

本發(fā)明還提供了上述調(diào)控序列、表達(dá)載體、表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種用于提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因表達(dá)的調(diào)控序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或者如SEQ ID NO:2所示，或者如SEQ ID NO:3所示。

本發(fā)明中的調(diào)控序列分別為人CMV啟動(dòng)子核心序列(hCPE)、合成的調(diào)控元件(SEE)、人巨細(xì)胞病毒即早期增強(qiáng)子(hCMVE)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。