[發明專利]一種A1/A2β-酪蛋白的質譜檢測方法

有效

• 申請號: 201810316627.6
• 申請日: 2018-04-10
• 公開（公告）號: CN108519485B
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發明（設計）人: 古淑青;鄧曉軍;趙超敏;方真;韓麗;王敏
• 申請（專利權）人: 上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N30/02
• 代理公司: 上海科律專利代理事務所(特殊普通合伙) 31290
• 代理人: 金碎平;袁亞軍

本發明公開了一種A1/A2β?酪蛋白的質譜檢測方法，包括如下步驟：a)獲取A2β?酪蛋白的氨基酸序列；b)將A2β?酪蛋白的67位氨基酸脯氨酸修改為組氨酸，獲得A1β?酪蛋白的氨基酸序列；c)利用特異性的酶解方法將待檢測蛋白質切成小分子量的多肽片段混合物，利用靜電場軌道阱高分辨質譜全掃描模式檢測混合物中各多肽的分子量和碎片信息，并與前面的氨基酸序列進行比對，定性判斷是否存在A1或A2β?酪蛋白的特征肽段；d)挑選定性為A1或A2β?酪蛋白的特征肽段，合成其同位素內標肽段，利用串聯四級桿質譜建立多反應監測方法進行定量分析。本發明能夠同時實現A1、A2β?酪蛋白的定性鑒定和定量研究，靈敏度高，準確度高，抗干擾能力強，可廣泛應用于A2乳制品的確證和檢測。

技術領域

本發明涉及一種蛋白質質譜檢測方法，尤其涉及一種A1/A2β-酪蛋白的質譜檢測方法。

背景技術

酪蛋白是牛奶中含量最豐富的蛋白質，也是重要的生物活性肽的來源。β-酪蛋白約占牛奶中酪蛋白含量的40％左右，是氨基酸的重要來源，同時在體內傳遞重要的礦物質(如鈣和磷等)，促進其消化吸收。β-酪蛋白由染色體6上的CSN2基因編碼，這是一個具有高度多態性的基因，迄今為止，已有15種不同的Beta-酪蛋白基因變體被鑒定，其中A1和A2β-酪蛋白是牛β-酪蛋白是最常見的兩種存在形態。A2β-酪蛋白被公認為是現代奶牛β-酪蛋白的天然原型。最初，所有家養的牛只含有A2β-酪蛋白，大約5000年前歐洲奶牛雜交導致牛奶蛋白質變異后出現了A1β-酪蛋白，即今天全球普遍存在的A1類牛奶β-酪蛋白。

A1和A2β酪蛋白的67位氨基酸不同，在A1上面是組氨酸(CAT)，A2則是脯氨酸(CCT)，這種差異導致了表達-酪蛋白的二級結構發生了關鍵的構象變化。A1β酪蛋白在消化過程中可生成β-酪啡肽-7(BCM-7)，而A2β-酪蛋白則不會生成BCM-7。BCM-7是一種外啡肽，可與機體多種系統相互作用。多項研究表明，A1或BCM-7與部分嬰兒的1型糖尿病風險升高、免疫反應、消化功能紊亂,自閉癥和呼吸功能障礙之間存在關聯。A2β-酪蛋白與母乳中的β-酪蛋白相似，由于不會產生A1β-酪蛋白在消化過程中的代謝產物BCM-7，可以有效降低BCM-7干擾體內自然消化過程的機會，更有利于促進嬰幼兒的生長發育。因此，市面上不斷推出標注有“A2”字樣的嬰幼兒及成人配方奶粉和牛奶，價格較一般產品高出許多，聲稱只含有A2β-酪蛋白而不含有A1β-酪蛋白。

其實，A2β-酪蛋白的奶源非常稀有。不是所有的奶牛都能產出只含純凈A2β-酪蛋白而不含A1β-酪蛋白的牛奶。現今，西方的奶牛中只有約30％的奶牛是純正的A2奶牛，由其所產的牛奶只含100％純凈A2β-酪蛋白，其余均是A1β-酪蛋白或A1和A2β-酪蛋白的混合體。但是由于其宣稱的對消化系統及人體的多種有益性，許多消費者仍趨之若鶩。如何確保產品中的β-酪蛋白確實是只含有A2β-酪蛋白而沒有A1β-酪蛋白呢？目前僅有少量文獻報道，采用的檢測方法主要包括液相色譜法檢測和液相色譜-質譜聯用法。質譜聯用電噴霧電離(ESI)是迄今為止最可靠的多肽檢測技術，但是目前基于質譜的檢測技術主要集中在檢測A1的酶解產物BCM-7上，無法同時對A2β-酪蛋白進行定性和定量檢測。由于缺乏有效的檢測手段，國內國際上也沒有出臺相關的檢測標準，因而，消費者的利益無法得到保障。

因此針對目前A2乳制品市場逐漸擴大，而A2β-酪蛋白的定性和定量檢測方法缺乏的問題，有必要一種新型的基于蛋白質組學的方法，確定A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白的特征肽段，建立多反應監測方法進行定量分析。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種A1/A2β-酪蛋白的質譜檢測方法，能夠同時實現A1、A2β-酪蛋白的定性鑒定和定量研究，靈敏度高，準確度高，抗干擾能力強，可廣泛應用于A2乳制品的確證和檢測。