[發明專利]一種通過合成生物學制備乙硫異煙胺煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法

在審

• 申請號: 201810313735.8
• 申請日: 2018-04-10
• 公開（公告）號: CN108624641A
• 公開（公告）日: 2018-10-09
• 發明（設計）人: 王緒德;周亞鳳;畢利軍;周盈;張曉麗
• 申請（專利權）人: 佛山科學技術學院
• 主分類號: C12P19/36
• 分類號: C12P19/36;C12R1/19
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 王國標

1.一種通過合成生物學制備乙硫異煙胺煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，包括步驟：

1).PCR擴增ethA和inhA的DNA序列片段：

1-1).以SEQ ID №1所示的引物ethANFP和SEQ ID №2所示的引物ethAKRP，進行ethA的PCR擴增；以SEQ ID №3所示的引物inhABFP和SEQ ID №4所示的引物inhAHRP，進行inhA的PCR擴增；PCR擴增的目的DNA片段經核酸凝膠電泳后回收，-20℃保存備用；

2).構建pCDFDuet-inhA-ethA質粒：

2-1).擴大培養含有pCDFDuet-1質粒的大腸桿菌DH5α菌株，抽提pCDFDuet-1質粒；

2-2).將步驟1-1擴增后回收的ethA序列片段和步驟2-1獲得的pCDFDuet-1質粒分別都使用NdeⅠ和KpnⅠ限制性內切酶進行雙酶切；將酶切后回收的ethA序列片段和線性化含有粘性末端的質粒pCDFDuet-1使用T4 DNA連接酶16℃連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞并單克隆擴大培養，經抽提后獲得pCDFDuet-ethA質粒；

2-3).將pCDFDuet-ethA質粒和步驟1-1擴增后回收的inhA序列片段分別都使用BamHⅠ和HindⅢ限制性內切酶進行雙酶切；將酶切后回收的inhA序列片段和線性化含有粘性末端的質粒pCDFDuet-ethA使用T4 DNA連接酶16℃連接反應過夜，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞并單克隆擴大培養，經抽提后獲得pCDFDuet-inhA-ethA質粒；

3).純化InhA蛋白：

3-1).將pCDFDuet-inhA-ethA質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞單克隆擴大培養，控溫16℃并添加0.5mM IPTG誘導蛋白表達，繼續200rpm震蕩培養2-3小時，然后加入100mg/mL的乙硫異煙胺培養16小時；

3-2).離心收集菌體，緩沖液洗滌后重懸，再超聲破碎后離心取上清液經結合緩沖液預平衡的Ni²⁺-NTA親和層析柱，然后使用5個柱體積的第一洗脫緩沖液洗脫不能結合到層析柱上的雜蛋白，進一步使用第二洗脫緩沖液洗脫并收集獲得的目的InhA蛋白；所述第一洗脫緩沖液為50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，80mM咪唑，pH 8.0；所述第二洗脫緩沖液為50mMTris-HCl，0.5M NaCl，250mM咪唑，pH 8.0；

4).純化乙硫異煙胺煙酰胺腺嘌呤二核苷酸化合物：

4-1).使用Millipore 10K超濾管濃縮純化的InhA蛋白并使用pH 8.0的50mM Tris-HCl置換原有的洗脫液，將純化的InhA蛋白濃縮換液至1mL，將濃縮液100℃加熱50秒，然后離心收集上清，將獲得的上清液添加到Millipore Microcon 3過濾柱中10000g 4℃離心1小時過濾除去蛋白，離心濾液即含有乙硫異煙胺煙酰胺腺嘌呤二核苷酸。

2.根據權利要求1所述的通過合成生物學制備乙硫異煙胺煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于：各步驟所述的單克隆擴大培養具體為將細胞涂布于含有50μg/mL鏈霉素的LB固體平板，平板放置37℃恒溫培養箱培養過夜；挑取平板上長出的單克隆菌落接種于含有50μg/mL鏈霉素的LB液體培養基37℃搖床200rpm震蕩過夜培養。

3.根據權利要求1所述的通過合成生物學制備乙硫異煙胺煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于：步驟2-1所述擴大培養是將大腸桿菌DH5α菌株接種于含有50μg/mL鏈霉素的LB液體培養基37℃搖床200rpm震蕩過夜培養。

4.根據權利要求1所述的通過合成生物學制備乙硫異煙胺煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于：步驟2-2單克隆擴大培養獲得的質粒使用NdeⅠ和KpnⅠ限制性內切酶進行雙酶切后經核酸凝膠電泳檢測驗證DNA片段ethA連接到pCDFDuet-1載體上獲得質粒pCDFDuet-ethA。