[發(fā)明專利]一種通過合成生物學(xué)制備異煙肼煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810313698.0
• 申請日: 2018-04-10
• 公開（公告）號: CN108611358A
• 公開（公告）日: 2018-10-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王緒德;周亞鳳;畢利軍;周盈;張曉麗
• 申請（專利權(quán)）人: 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12N9/02;C12P19/36
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 王國標(biāo)

本發(fā)明提供了一種通過合成生物學(xué)制備異煙肼煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，包括步驟：1).PCR擴(kuò)增katG和inhA的DNA序列片段；2).構(gòu)建pTrcHis2c?katG質(zhì)粒；3).構(gòu)建pET28a?inhA質(zhì)粒；4).純化InhA蛋白；5).純化INH?NAD化合物。本發(fā)明的有益效果是：在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)直接合成INH?NAD并通過超濾管濃縮純化和短時間加熱后離心、過濾等步驟實(shí)現(xiàn)INH?NAD的純化分離。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌(結(jié)核菌)感染而引起的傳染性疾病。結(jié)核病是困擾人類時間最長、危害最大的傳染病之一。1882年，結(jié)核病的病原菌結(jié)核分枝桿菌才被德國科學(xué)家科赫分離并鑒定。在此之前，結(jié)核病在全球范圍內(nèi)多次發(fā)生大規(guī)模流行，并且被稱為“白色瘟疫”。自五十年代以來，人類不斷發(fā)現(xiàn)了有效的抗結(jié)核藥物，使TB的流行得到了一定控制。抗結(jié)核藥物是一把雙刃劍，它既能夠治療TB，但是它也能夠?qū)е陆Y(jié)核分枝桿菌出現(xiàn)對應(yīng)的抗結(jié)核藥物耐藥株。

在今天全球TB的防控面臨巨大的挑戰(zhàn)，尤其是結(jié)核分枝桿菌和HIV(TB/HIV)共感染，耐多藥(multidrug-resistant，MDR)和廣泛耐藥(extensively drug-resistant，XDR)結(jié)核病病例的出現(xiàn)。用于治療結(jié)核病的藥物通常分為一線藥物和二線藥物，目前常用的一線藥物主要有異煙肼(INH)，利福平(RIF)，吡嗪酰胺(PZA)和乙胺丁醇(EMB)，一線藥物療效顯著并能縮短整個治療的周期。二線藥物主要有：氨基糖苷類(aminoglycosides)：卡那霉素(kanamycin)和丁胺卡那霉素(amikacin)；環(huán)多肽類(polypeptides)：卷曲霉素(capreomycin)、紫霉素(viomycin)和恩維霉素(enviomycin)；氟喹諾酮類(fuoroquinolones)：氧氟沙星(ofoxacin)、加替沙星(gatifoxacin)和環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)；環(huán)絲氨酸(D-cycloserine)；碳硫胺類(thionamides)：乙硫異煙胺(Ethionamide，ETH)和丙硫異煙胺(prothionamide)；PAS。二線藥物毒性更大并且沒有一線藥物顯著的療效，主要用于MDR-TB的治療以及延長治療時間。異煙肼于1956年發(fā)現(xiàn)，是一種應(yīng)用廣泛的一線抗結(jié)核藥物。該藥物發(fā)揮抗結(jié)核活性首先需要蛋白KatG活化，活化后與NAD形成有活性的抗結(jié)核化合物異煙肼煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(INH-NAD)，該化合物結(jié)合到InhA蛋白中進(jìn)而抑制其活性并最終影響結(jié)核菌細(xì)胞壁中分枝菌酸(Mycolic acid)的合成進(jìn)而殺死結(jié)核菌(見下圖)。異煙肼發(fā)揮抗結(jié)核活性必須是其活化后的化合物(INH-NAD)，臨床分離耐藥性結(jié)核菌中InhA蛋白通常會發(fā)生突變，從而導(dǎo)致INH-NAD不能結(jié)合到InhA蛋白上導(dǎo)致結(jié)核菌耐受INH作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服上述不足之處，提供一種在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)直接合成INH-NAD并快速高效純化分離該化合物的方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種通過合成生物學(xué)制備異煙肼煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，包括步驟：

1).PCR擴(kuò)增katG和inhA的DNA序列片段：

1-1).以SEQ ID №1所示的引物katGBglIIFP和SEQ ID №2所示的引物katGEcoRIRP，進(jìn)行katG的PCR擴(kuò)增；以SEQ ID №3所示的引物InhANcoIFP和SEQ ID №4所示的引物InhAHindШRP，進(jìn)行inhA的PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增的目的DNA片段經(jīng)核酸凝膠電泳后回收，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

2).構(gòu)建pTrcHis2c-katG質(zhì)粒：

2-1).擴(kuò)大培養(yǎng)含有pTrcHis2c質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α菌株，抽提pTrcHis2c質(zhì)粒；