[發明專利]一種催化效率提高的D,D-羧肽酶DacA突變體及其制備方法

有效

• 申請號: 201810311758.5
• 申請日: 2018-04-09
• 公開（公告）號: CN108410845B
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發明（設計）人: 許菲;楊海泉;陳媛;盧瀟;王浩坤;王拂祥;代瑤
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/48
• 分類號: C12N9/48;C12N15/57;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/06;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種催化效率提高的D,D?羧肽酶DacA突變體及其制備方法，屬于遺傳工程和酶工程領域。本發明公開了由大腸桿菌(Escherichia coli)BL21來源的D,D?羧肽酶DacA為母本，基于酶結構解析確定關鍵位點及突變方式，經分子生物學技術進行定點突變而獲得催化效率提高的DacA突變體。在此改造條件下，E.coli D,D?羧肽酶DacA的突變體K113G催化效率常數k_cat值提高最多，由6543.4s^?1提高至9428.1s^?1。利用此策略可以顯著提高D,D?羧肽酶DacA的催化效率，為其在代謝改造E.coli提高其胞外分泌水平等方面的應用提供了基礎。此策略對其它酶的性質改造具有重要的指導意義。

技術領域

本發明涉及一種催化效率提高的D,D-羧肽酶DacA突變體及其制備方法，屬于酶工程領域。

背景技術

大腸桿菌(Escherichia coli)是最廣泛使用的用于重組蛋白質生產的細菌種類之一，它具有諸多優點(如翻譯后修飾-二硫鍵形成等)。但在大腸桿菌中，大多數蛋白質被轉運到細胞的周質空間而不能直接到達胞外，這容易帶來諸多問題(如蛋白質生產不連續等)。肽聚糖作為細胞壁的主要成分，有助于維持細胞結構的魯棒性。通過破壞細胞周圍的肽聚糖結構可增強大分子的細胞外生產水平。D,D-羧肽酶DacA可從肽聚糖側鏈切除末端D-丙氨酸殘基，其對于合成肽聚糖網絡及維持其結構穩定具有重要作用。

具有高催化效率的D,D-羧肽酶DacA可高效調控肽聚糖網絡合成，可應用于代謝改造E.coli提高其蛋白胞外分泌水平等方面。定點突變和定向進化是提高酶催化效率的兩種主要手段。定向進化雖然不需要準確的酶分子結構信息，但是需要建立一種能夠從大量的突變株中快速簡便的篩選到優勢菌株的方法。而定點突變，與定向進化相比，是一種更迅速、直接且節約成本的提高酶催化效率的方法。

發明內容

本發明基于已得到的D,D-羧肽酶DacA在E.coli中的表達平臺，利用定點突變技術，對D,D-羧肽酶DacA進行分子改造，以得到更適合代謝改造E.coli提高其蛋白胞外分泌水平等方面應用的催化效率提高的D,D-羧肽酶DacA突變體。

本發明提供了一種催化效率提高的D,D-羧肽酶DacA突變體，是通過定點突變方法在D,D-羧肽酶DacA酶催化結構域內(口袋區域)進行氨基酸替換，獲得了催化效率提高的D,D-羧肽酶DacA突變體。

所述D,D-羧肽酶DacA突變體是以SEQ ID NO.1為出發序列，在第113位氨基酸位置處做如下替換：賴氨酸替換成精氨酸、甘氨酸或組氨酸。

本發明還提供一種制備所述催化效率提高的D,D-羧肽酶DacA突變體的方法，具體步驟如下：

1)將編碼大腸桿菌D,D-羧肽酶DacA的基因(SEQ ID NO.2)，通過PCR方法克隆到質粒pET-28a(+)中，構建重組質粒pET28a-dacA(圖1)；

2)設計突變引物，對D,D-羧肽酶DacA基因序列進行定點突變，將所述位點的氨基酸進行替換，獲得含有編碼突變D,D-羧肽酶DacA的基因序列的重組載體；

3)將突變后重組載體轉化E.coli BL21，誘導表達，獲得D,D-羧肽酶DacA突變體。

本發明提供的D,D-羧肽酶酶突變體催化效率顯著提高，由原始菌株的6543.4s^-1提高至9428.1s^-1。相對于采用篩菌或誘變等手段，縮短了酶學性質改造時間。所得D,D-羧肽酶DacA突變體可用于催化Park核苷酸生成D-丙氨酸、代謝改造微生物以提高其胞外蛋白分泌表達水平。

附圖說明

圖1：重組質粒pET28a-dacA的圖譜。