[發(fā)明專利]一種高通量轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810308696.2
• 申請(qǐng)日: 2018-04-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108531475A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-09-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳翠霞;王偉棟;劉文雪;葛春霞
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種高通量轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于：具體步驟如下：

1)mRNA的純化

利用帶有oligo(dT)的磁珠將mRNA特異性吸附并分離出來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)mRNA的純化；

2)mRNA片段化

將mRNA與反轉(zhuǎn)錄第一鏈合成Buffer混合均勻，94℃處理1min50s，可將其打斷成200-600bp長(zhǎng)度的片段；

3)反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈合成

以上一步反應(yīng)所生成的mRNA片段作為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一條鏈，生成RNA，DNA雜交雙鏈，并利用核酸純化磁珠從反應(yīng)體系中將雜交鏈分離純化出來(lái)，用于后續(xù)操作；

4)cDNA第二鏈合成

利用RNaseH降解上一步反應(yīng)所得的雜交鏈中的RNA鏈，然后再利用DNA聚合酶補(bǔ)齊第二鏈，生成雙鏈cDNA，并用磁珠吸附DNA雙鏈，丟棄上清部分；吸附用的磁珠留存在管內(nèi)，以便進(jìn)行重復(fù)利用；

5)末端修復(fù)

針對(duì)反轉(zhuǎn)錄后cDNA形成的3’和5’突出末端，用酶和dNTP進(jìn)行末端補(bǔ)平，形成3’和5’平末端；

6)加腺苷酸A

利用常用酶將dATP添加到上步反應(yīng)所得的平末端DNA雙鏈末端，反應(yīng)得到帶有A尾的DNA雙鏈；

7)Adapter連接

利用T4DNA Ligase將Universal adapter連接至上一步反應(yīng)所得的DNA片段的兩端，反應(yīng)結(jié)束后加入磁珠吸附，分離純化反應(yīng)產(chǎn)物；

8)PCR富集文庫(kù)

利用高保真DNA聚合酶對(duì)加接頭后的DNA雙鏈進(jìn)行富集工作，反應(yīng)完成后通過(guò)加入磁珠吸附，分離得到500-600bp大小范圍內(nèi)的DNA片段，文庫(kù)構(gòu)建完成。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于：構(gòu)建完成后還有如下步驟：

9)文庫(kù)檢測(cè)

使用Qubit 2.0檢測(cè)所構(gòu)建文庫(kù)的濃度，利用瓊脂糖凝膠電泳和Agilent2100Bioanalyzer檢測(cè)文庫(kù)的質(zhì)量；

10)樣品混勻

將上一步中所有樣品統(tǒng)一稀釋到接近同一濃度，利用Qubit 2.0對(duì)稀釋后的樣品濃度進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果將樣品等量混勻。