[發明專利]一種人端粒酶逆轉錄酶抗原肽及其制備方法

有效

• 申請號: 201810308276.4
• 申請日: 2018-04-08
• 公開（公告）號: CN108753751B
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 李黃金;趙林;張鴻
• 申請（專利權）人: 廣東藥科大學
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12N15/70;C12N1/12;C12N15/11;C12R1/19
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛

本發明公開了一種人端粒酶逆轉錄酶（hTERT）抗原肽及其編碼基因，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。本發明將表位肽預測軟件與序列親水性分析軟件以及實驗驗證相結合，篩選出hTERT的565aa～665aa片段作為目的抗原肽，通過菌落PCR、DNA測序鑒定證實成功構建了hTERTsupgt;565aa～665aa/supgt;工程菌株，SDS?PAGE結果表明特異性表達產物大小與理論值一致，并以包含體形式表達，包含體蛋白可溶于8M尿素，鎳柱純化可獲得純度為90%以上的變性蛋白，再經稀釋法復性即可得到hTERTsupgt;565aa～665aa/supgt;抗原肽。成功獲得可在大腸桿菌中高效表達、并能有效溶解和復性的hTERT抗原肽，通過基因工程的方法建立其制備方法，獲得純度90%以上的復性后抗原肽，為后續腫瘤疫苗的開發應用奠定了基礎。

技術領域

本發明涉及生物醫藥領域，更具體地，涉及一種人端粒酶逆轉錄酶抗原肽及其制備方法。

背景技術

人端粒酶逆轉錄酶（human?telomerase?reverse?transcriptase，即hTERT）是人端粒酶的催化亞單位，在超過85%的腫瘤細胞表達，而在正常組織中很少表達。許多研究表明，來源于hTERT的多肽可經MHC?Ⅰ類分子加工遞呈，激發腫瘤特異性CTL反應，從而殺死不同組織來源的腫瘤細胞。作為一種腫瘤相關抗原，hTERT成為近年腫瘤免疫治療研究中較為理想的靶標。基于hTERT的DC疫苗、腫瘤多肽疫苗已經開始進入臨床實驗中，展示了良好的反應性和療效。

hTERT可作為腫瘤相關抗原用于腫瘤疫苗的研發，但由于其結構的復雜性，難以在大腸桿菌表達系統中高效制備，從而影響了其在腫瘤免疫治療領域的應用。

發明人前期篩選hTERT的高免疫原性抗原肽片段，將hTERT基因截斷成三個片段，分別導入大腸桿菌中進行表達。結果顯示，只有480aa～665aa這個片段能夠以包含體的形式進行表達，其它兩個片段則無法表達。在接下來的研究中卻發現該片段無法在8M尿素中裂解，在加入β-巰基乙醇等還原劑后還是無法溶解，導致hTERT?抗原肽的制備無法進行。序列分析發現其517和528位氨基酸是半胱氨酸，且540aa～564aa這段序列疏水性較強。推測這段序列在大腸桿菌中可進行高效的翻譯，但翻譯后的肽鏈由于分子間較強的疏水相互作用以及錯配的二硫鍵，使其形成了結構致密的包含體，這種包含體無法通過尿素和還原劑溶解，后期的復性和純化便無法進行。鑒于hTERT在腫瘤免疫治療中的重要地位，發明人結合多種抗原肽預測軟件和親水性分析軟件，在原有研究的基礎上重新設計，從而找到一種新的hTERT抗原肽，并找到了其高效制備方法，為基于該抗原肽的腫瘤免疫治療打下了基礎。

發明內容

本發明的目的是為了克服現有技術的不足，提供一種可在大腸桿菌中高效表達、并能有效溶解和復性的人端粒酶逆轉錄酶抗原肽，并建立了相應的制備方法，為后續腫瘤疫苗的開發應用奠定了基礎。

本發明的第一個目的是提供一種人端粒酶逆轉錄酶抗原肽。

本發明的第二個目的是提供一種編碼人端粒酶逆轉錄酶抗原肽的基因。

本發明的第三個目的是提供一種重組質粒。

本發明的第四個目的是一種工程菌。

本發明的第五個目的是提供一對擴增以上所述基因的引物。

本發明的第六個目的是提供所述基因、所述重組質粒、所述工程菌或引物任一在制備所述人端粒酶逆轉錄酶抗原肽中的應用。

本發明的第七個目的是提供一種人端粒酶逆轉錄酶抗原肽的制備方法。

為了實現上述目的，本發明是通過以下技術方案予以實現的：