[發(fā)明專利]一種基于圖位克隆原理針對植物基因組測序且分離群體為亞種間雜交的基因精細定位方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201810305873.1 | 申請日： | 2018-04-08 |
| 公開（公告）號： | CN108441574A | 公開（公告）日： | 2018-08-24 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 袁運棟;王永紅 | 申請（專利權(quán)）人： | 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所 |
| 主分類號： | C12Q1/6895 | 分類號： | C12Q1/6895;G06F19/22;G06F19/18 |
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| 地址： | 100101 北京市朝陽區(qū)*** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 植株 分離群體 測序 精細定位 亞種 突變體植株 植物基因組 目標(biāo)表型 圖位克隆 基因 雜交 提取基因組DNA 比對結(jié)果 全基因組 植物功能 基因組 比對 構(gòu)建 親本 篩選 參考 節(jié)約 應(yīng)用 分析 | ||
本發(fā)明公開了一種基于圖位克隆原理針對植物基因組測序且分離群體為亞種間雜交的基因精細定位方法。本發(fā)明的方法包括如下步驟：(1)采用植株甲和植株乙為親本，構(gòu)建F2代分離群體；植株甲為具有所述目標(biāo)表型的突變體植株；植株乙為與所述突變體植株屬于同一種但不同亞種的植株；(2)從步驟(1)得到的F2代分離群體中篩選具有所述目標(biāo)表型的植株，提取基因組DNA，得到一個特異DNA池；對植株甲、植株乙和特異DNA池進行全基因組測序；(3)將步驟(2)得到的測序結(jié)果與植物參考基因組進行比對；(4)基于步驟(3)的比對結(jié)果進行定位分析。本方法具有結(jié)果準(zhǔn)確可靠、節(jié)約時間、人力等優(yōu)點，可應(yīng)用于植物功能基因的精細定位。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種基于圖位克隆原理針對植物基因組測序且分離群體為亞種間雜交的基因精細定位方法。
背景技術(shù)
基因定位是圖位克隆研究中的重要環(huán)節(jié)。圖位克隆(Map-based cloning)又稱定位克隆(positional cloning)，1986年首先由劍橋大學(xué)的Alan coulson提出，用該方法分離基因是根據(jù)功能基因在基因組中都有相對穩(wěn)定的基因座，再利用分子標(biāo)記技術(shù)對目的基因進行精確定位的基礎(chǔ)上，用與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記篩選DNA文庫，從而構(gòu)建目的基因區(qū)域的物理圖譜，再利用此物理圖譜通過染色體步移逐步逼近目的基因或通過染色體登陸的方法，最終克隆目的基因并通過遺傳轉(zhuǎn)化實驗驗證該基因的功能。其中圖位克隆方法在尋找雜交親本之間的多態(tài)分子標(biāo)記需要花費較多時間驗證，甚至在染色體步移逐步逼近目的基因或通過染色體登陸時無法得到可用的多態(tài)標(biāo)記，導(dǎo)致基因工作無法開展；另一方面在基因的精細定位步驟中，需要較多分離群體中的突變體表型植株進行篩選重組子，擴大了人力物力成本。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于圖位克隆原理針對植物基因組測序且分離群體為亞種間雜交的基因精細定位方法。
本發(fā)明提供了一種對植物基因組中決定目標(biāo)表型的功能基因進行定位的方法，包括如下步驟：
(1)采用植株甲和植株乙為親本，構(gòu)建F2代分離群體；所述植株甲為具有所述目標(biāo)表型的突變體植株；所述植株乙為與所述突變體植株屬于同一種但不同亞種的植株；
(2)從步驟(1)得到的F2代分離群體中篩選若干具有所述目標(biāo)表型的植株，然后將來源于各個植株的材料等質(zhì)量混合后提取基因組DNA，得到一個特異DNA池；分別對所述植株甲、所述植株乙和所述特異DNA池進行全基因組測序；
(3)將步驟(2)得到的各個全基因組測序結(jié)果與植物參考基因組進行比對；所述植物參考基因組為所述突變體植株屬于同一種的植物的參考基因組；
(4)基于步驟(3)的比對結(jié)果進行定位分析，得到?jīng)Q定所述目標(biāo)表型的功能基因在植物染色體上的物理位置。
所述步驟(2)中，所述“若干具有所述目標(biāo)表型的植株”具體可為50株具有所述目標(biāo)表型的植株。
所述步驟(4)中，所述定位分析包括如下步驟：(a1)獲得所述植株甲和所述植株乙的植株之間的差異位點；(a2)基于所述特異DNA池的全基因組測序結(jié)果，計算步驟(a1)得到的每個差異位點的遺傳距離；(a3)從每條染色體的第一個堿基開始，在1Mbp的物理距離內(nèi)計算差異位點遺傳距離的平均值，10kb物理距離向前滑動一次，通過利用R語言作圖工具繪制每個差異位點的遺傳距離點和差異位點遺傳距離的平均值的趨勢線，以小于10cM為基因連鎖區(qū)域，峰形圖谷底為緊密連鎖區(qū)域，在10cM兩側(cè)為決定所述目標(biāo)表型的功能基因的錨定區(qū)間。
所述步驟(a2)中，所述遺傳距離＝野生型序列數(shù)/(突變體序列數(shù)+野生型序列數(shù))×100。
所述步驟(a2)中，所述趨勢線的位置坐標(biāo)為1Mbp位置中的起始位置和結(jié)束位置的平均值
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