[發(fā)明專利]一種基于QPCR定量檢測畜禽肉中羊源性成分的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810303676.6
• 申請日: 2018-04-03
• 公開（公告）號: CN108384863A
• 公開（公告）日: 2018-08-10
• 發(fā)明（設計）人: 趙新;蘭青闊;陳銳;王永;朱珠
• 申請（專利權(quán)）人: 天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.用于鑒定羊源性成分含量的PCR擴增引物及探針引物，其特征在于，包括內(nèi)參基因Ref-8引物正向序列：5′-GCTTGAGGGCTGAGTGATAGATTC-3′，Ref-8反向序列：5′-ACACATAAGCTCATCGCAAATCAT-3′，Ref-8探針序列：5′-FAM-CCTGCCTGAAGCATCCCAGTGTGTTT-BHQ1-3′；羊源種屬特異性基因Mutton-3引物正向序列：5′-GATCAAAGGCAGAGATTACCAGTCA-3′，Mutton-3反向序列：5′-TTGTGGTTTGTGATTGATTTTAGTCA-3′，Mutton-3探針序列：5′-FAM-TCGCTCTTCCCCTGCTCCAGACAC-BHQ1-3′。

2.一種采用權(quán)利要求1所述內(nèi)參基因和羊源種屬特異性基因，快速鑒定羊源性成分含量的方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)采用權(quán)利要求1所述的內(nèi)參基因PCR引物和探針及Premix Ex Taq(Probe qPCR)預混液，加入供試樣品模板DNA進行PCR擴增；其中的PCR擴增反應體系：擴增反應的總體積為20μL，其各種成分分別為：2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)預混液10μL，上下游引物各1μL(濃度為10μmol/L)，探針引物0.4μL(濃度為10μmol/L)，模板DNA 1μL(濃度為50/μL)，用滅菌去離子水補齊至20μL；

反應程序：95℃變性5min；進行45次循環(huán)擴增反應(95℃變性15s，60℃退火延伸1min)；在第二階段的退火延伸(60℃)時段收集熒光信號。

(2)構(gòu)建羊源性成分定量檢測標準參照物，采取SDS-硅膠柱改良方法提取DNA梯度稀釋，配制標準曲線。標準溶液中羊源性成分的濃度為50、10、5、1、0.5ng/μL，每個反應加入1μL DNA做模板，每個反應分別對應50、10、5、1、0.5ng，每個反應設置3個平行。根據(jù)標準DNA溶液PCR反應的Ct值及初始模板濃度的對數(shù)分別繪制Ref-8內(nèi)參基因和Mutton-3羊源特異性基因的標準曲線。

(3)設定閾值后，熒光定量PCR儀的數(shù)據(jù)分析軟件自動計算每個反應的Ct值和靶標濃度，并記錄。按照公式A＝B/[B+(C-B)/D]×100％，計算出試樣中羊源性成分種屬特異性基因百分含量。

3.如權(quán)利要求2所述的鑒定方法，公式中A為羊源性成分種屬特異性基因百分含量，B為Mutton-3羊源種屬特異性基因的靶標濃度，C為Ref-8內(nèi)參基因的靶標濃度，D為羊源性成分中摻入其他動物源性成分的校正系數(shù)，即為羊基因組大小/摻入動物基因組大小。