[發(fā)明專利]一種高靈敏度的黃熱病毒人源單克隆抗體及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810302091.2
• 申請日: 2018-04-04
• 公開（公告）號: CN110343172B
• 公開（公告）日: 2021-09-03
• 發(fā)明（設計）人: 嚴景華;高福;李燕;馬素芳;仵麗麗
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C12N15/13;G01N33/569;A61K39/42;A61P31/14
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發(fā)明公開了一種高靈敏度的黃熱病毒人源單克隆抗體及其應用，屬于醫(yī)藥技術領域。本發(fā)明以大腸桿菌表達的黃熱病毒E蛋白作為抗原，通過流式分選，從一例康復期患者的PBMCs中篩選到可以特異結合黃熱病毒E蛋白的記憶B細胞，然后對篩選的單一B細胞進行RT?PCR及PCR擴增，獲得抗體的可變區(qū)片段，并進一步與恒定區(qū)連接至表達載體中。本發(fā)明獲得的6株人源抗體均有很強的YFV中和活性，IC 50值達0.03～3.5ug/mL，可以完全或部分保護小鼠免受致死劑量的YFV China的攻擊。本發(fā)明的6株人源抗體有著臨床治療或預防YFV感染的應用價值。

技術領域

本發(fā)明涉及一種高靈敏度的黃熱病毒人源單克隆抗體及其應用，屬于醫(yī)藥技術領域。

背景技術

黃熱病毒(yellow fever virus，YFV)，單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科黃病毒屬，是一種蚊媒傳播的可引起人類致病的病原體，同一科病毒還包括寨卡病毒(zikavirus，ZIKV)、登革病毒(dengue virus，DENV)、西尼羅病毒(west nile virus，WNV)等。YFV是引起黃熱病的重要病原，嚴重時會引起出血熱伴隨多器官衰竭，尤其是肝、脾、淋巴結、心、腎。

在1996年時，科學家曾估計每年在非洲和南美洲黃熱病毒可引起20萬人感染，30萬人死亡。近兩年，巴西、安哥拉和剛果民主共和國等地發(fā)生了黃熱病暴發(fā)，已造成數(shù)百人死亡，死亡率達14％，中國在2016年有11例輸入病例。目前，臨床上已有減毒疫苗(YFV17D)，但疫苗短缺和接種率不足導致疾病頻繁爆發(fā)，非免疫個體仍處于危險之中。在YFV感染后，臨床上沒有可用于治療該疾病的有效的特異性藥物。

迄今為止，中和抗體已被證明是治療病毒性疾病的有效方法，包括人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒和其它黃病毒等。黃病毒表面的E蛋白(Envelope)識別細胞表面的受體，進而促進病毒膜與細胞膜發(fā)生膜融合，由三個不同的結構域(DI，DII和DIII)完成這些過程。因此，E蛋白是機體免疫系統(tǒng)產生的中和抗體作用的重要表位。

已有研究發(fā)現(xiàn)有一些人源抗體具有中和活性，可以中和2001年之前的部分黃熱病毒毒株，如：5A、7A、R3(27)等可以中和Central African Republic(CAR)1986、Ethiopia1961、 Senegal1990、Nigeria1987、Ghana 1927(Asibi)和疫苗株YFV 17D。然而，RNA病毒在抗體壓力下，具有高突變的特性，盡管已經有些中和抗體被鑒定，但是更多的針對不同表位的新的抗體對于治療是必不可少的。本發(fā)明的目的是鑒定特異的具有保護作用的新的YFV中和抗體。

發(fā)明內容

為了解決上述問題，本發(fā)明首先以大腸桿菌表達的YFV-E蛋白作為抗原，通過流式分選，從一例康復期YFV患者的PBMCs中篩選到可以特異結合YFV-E蛋白的記憶B細胞，然后對篩選的單一B細胞進行RT-PCR和PCR擴增，獲得6株抗體的可變區(qū)片段，并進一步與恒定區(qū)連接至表達載體中。測序正確后，經哺乳動物細胞表達、純化，進行一系列的功能檢測，包括與YFV-E蛋白的結合力，體外中和效果，體內保護能力等檢測。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種抗體，如(1)～(6)任一所示：

(1)抗體命名為YD2，其重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

(2)抗體命名為YD25，其重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

(3)抗體命名為YD62，其重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；

(4)抗體命名為YD86，其重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；