[發(fā)明專利]小分子誘導(dǎo)人脂肪干細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810299979.5
• 申請日: 2018-04-04
• 公開（公告）號: CN108486039B
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郭曉令;葛仁山;李超;林振坤;李曉珩;洪婷婷;陳顯武;陳勇
• 申請（專利權(quán)）人: 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院;溫州醫(yī)科大學(xué)附屬育英兒童醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/0775
• 代理公司: 溫州名創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33258
• 代理人: 曾建芳

1.一種小分子誘導(dǎo)人脂肪干細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：①將獲得的人源脂肪組織通過I型膠原酶分離出脂肪干細(xì)胞，該I型膠原酶按照質(zhì)量體積比0.1％加入到DMEM低糖(DMEM-LG)培養(yǎng)基中，然后用含質(zhì)量體積比為0.25％EDTA的胰酶消化獲取傳代培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞；②對獲取的傳代培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞進行流式細(xì)胞分析鑒定；③采用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞完成成脂分化鑒定；④采用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞完成成骨分化鑒定；⑤待脂肪干細(xì)胞完成步驟②-④的鑒定處理后，對脂肪干細(xì)胞進行免疫熒光處理：于室溫進行膜通透化處理后直接加入一抗4℃孵育過夜，然后加入二抗室溫孵育，接著染色室溫孵育；⑥將脂肪干細(xì)胞接種培養(yǎng)5天后，進行分化培養(yǎng)，在分化培養(yǎng)過程中加入小分子促進脂肪干細(xì)胞分化成睪丸間質(zhì)細(xì)胞，小分子成分包括SAG、22OHC、Li、PDGF-AA、FGF2、Androgen、LH，然后手工剔除非睪丸間質(zhì)細(xì)胞(ALCs)樣細(xì)胞，并富集分化得到的靶細(xì)胞(ADSC-LCs)，并完成對靶細(xì)胞的免疫熒光鑒定和逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測鑒定分析；

所述步驟⑥中對脂肪干細(xì)胞進行分化培養(yǎng)的過程中，將接種培養(yǎng)基換成分化培養(yǎng)基時，此時間點定義為分化第0天，然后在分化第0至7天，每隔2天向分化培養(yǎng)基中外加0.5μMSAG、2μM 22OHC、10mM Li促進分化，在分化第7至14天，每隔2天向分化培養(yǎng)基中外加促增殖因子10ng/mL PDGF-AA和10ng/mL FGF2，以及加入促分化因子20μM Androgen，在分化第14至18天，每隔2天向分化培養(yǎng)基中外加促成熟因子50ng/mL LH和0.5μM SAG；脂肪干細(xì)胞在分化培養(yǎng)基ADSC-DIM中共誘導(dǎo)18天，每2天換1次分化培養(yǎng)基；

所述步驟⑥中分化培養(yǎng)時采用的分化培養(yǎng)基包括DMEM-F12、ITS、10ng/mL LH、0.2μMSAG、2μM 22OHC和5mM Li。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小分子誘導(dǎo)人脂肪干細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于：在誘導(dǎo)分化18天后，在顯微鏡下采用自制的玻璃細(xì)胞刮手動剔除非睪丸間質(zhì)樣細(xì)胞，剩余貼壁細(xì)胞采用質(zhì)量體積比0.25％EDTA消化后1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘富集，采用富集培養(yǎng)基(Enrichment Medium)重懸后轉(zhuǎn)移至預(yù)先用體積百分比1％Matrigel Coating處理即37℃孵育1小時以上的6孔板中富集培養(yǎng)7天，即第25天，所述富集培養(yǎng)基(EnrichmentMedium)包括DMEM-F12、體積百分比1％胎牛血清(FBS)、Sodiumpyruvate、Glutamax。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小分子誘導(dǎo)人脂肪干細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于：所述步驟③中的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括含100U/mL P/S雙抗和體積百分比10％FBS的DMEM/LG、10μM的胰島素、0.5mM的異丁基甲基黃嘌呤、1μM的地塞米松、200μM的吲哚美辛。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-2任意一項所述的小分子誘導(dǎo)人脂肪干細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于：所述步驟③中的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括含100U/mL P/S和體積百分比10％FBS的DMEM/LG、10μM的胰島素、0.5mM的異丁基甲基黃嘌呤、1μM的地塞米松、200μM的吲哚美辛。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的小分子誘導(dǎo)人脂肪干細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于：所述步驟④中成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括含100U/mLP/S雙抗和體積百分比10％胎牛血清(FBS)的DMEM/LG、50μM抗壞血酸磷酸鹽、1μM地塞米松、100μM甘油磷酸鹽。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-2任意一項所述的小分子誘導(dǎo)人脂肪干細(xì)胞分化為睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于：所述步驟④中成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括含100U/mLP/S雙抗和體積百分比10％胎牛血清(FBS)的DMEM/LG、50μM抗壞血酸磷酸鹽、1μM地塞米松、100μM甘油磷酸鹽。