[發明專利]一種促進枯草芽孢桿菌乙酰氨基葡萄糖合成的方法

有效

• 申請號: 201810299583.0
• 申請日: 2018-04-04
• 公開（公告）號: CN108424869B
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 劉龍;顧洋;鄧潔瑩;陳堅;堵國成;李江華
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/52;C12P19/26;C12R1/125
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種促進枯草芽孢桿菌乙酰氨基葡萄糖合成的方法，屬于遺傳工程領域。本發明是以重組枯草芽孢桿菌BSGNKAP2作為出發菌株，外源引入來源于蠟樣芽孢桿菌的丙酮酸羧化酶BalpycA，消除枯草芽孢桿菌中心碳代謝溢流，避免副產物乙偶姻的合成，進一步引入5個外源還原力代謝反應替換糖酵解途徑、三羧酸循環中產生NADH的反應，重構胞內還原力代謝，具體包括甘油醛?3?磷酸鐵氧還蛋白脫氫酶、異檸檬酸NAD⁺脫氫酶、蘋果酸醌脫氫酶、酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶和固氮酶鐵蛋白。在使用復合培養基搖瓶發酵過程中，重組菌株BSGNKAP8乙酰氨基葡萄糖的產量為24.50g/L，乙酰氨基葡萄糖/葡萄糖得率為0.469g/g，分別是出發菌株BSGNKAP2的1.97和2.13倍。

技術領域

本發明涉及一種促進枯草芽孢桿菌乙酰氨基葡萄糖合成的方法，屬于遺傳工程領域。

背景技術

在人體中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖單元的合成前體，其對修復和維持軟骨及關節組織功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被廣泛添加在藥物和營養膳食中來治療和修復關節損傷。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妝品和制藥領域也具有諸多應用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解蝦殼或蟹殼中甲殼素生產，然而，此方法產生的廢液對環境污染較為嚴重，而且得到的產品易引起過敏反應，不適宜海鮮過敏的人群服用。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種被廣泛用作食品酶制劑及重要營養化學品的生產宿主，其產品被FDA認證為GRAS(Generally Regarded as Safe)安全級別。枯草芽孢桿菌發酵生產乙酰氨基葡萄糖反應式為：

5/2glucose+ATP+5NAD⁺+2NH₃→GlcNAc+glutamate+ADP+5NADH+2CO₂+phosphate

該方程是通過計算從頭合成乙酰氨基葡萄糖的3個前體6磷酸果糖、乙酰輔酶A和谷氨酰胺得到，從方程中可以看出在乙酰氨基葡萄糖合成的過程中伴隨著大量的NADH的產生。過量生成的NADH對N-乙酰氨基葡萄糖途徑最大理論得率(Yc)產生巨大的消極影響。因為細胞要維持還原力平衡，過量產生的NADH將通過兩種方式消耗，一個參與其他代謝的合成(導致副產物的產生)，另外一方面被氧化產生ATP(導致發酵過程需要消耗大量O₂，同時也會造成菌體量大量生成)。此外，利用枯草芽孢桿菌合成乙酰氨基葡萄糖時會伴隨著代謝溢流，導致副產物乙偶姻的大量合成。因此，如何有效處理在伴隨乙酰氨基葡萄糖生成的NADH及乙酰氨基葡萄糖合成效率，同時避免中心碳代謝溢流，提碳原子經濟性，是微生物發酵法生產乙酰氨基葡萄糖產量的亟待解決問題。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供了一種消除枯草芽孢桿菌中心碳代謝溢流、平衡胞內還原力促進乙酰氨基葡萄糖合成的方法，該構建方法是外源引入來源于蠟樣芽孢桿菌的丙酮酸羧化酶BalpycA，消除枯草芽孢桿菌中心碳代謝溢流，避免副產物乙偶姻的合成。進一步引入5個外源還原力代謝反應替換糖酵解途徑、三羧酸循環中產生NADH的反應，重構胞內還原力代謝，具體包括甘油醛-3-磷酸鐵氧還蛋白脫氫酶、異檸檬酸NAD+脫氫酶、蘋果酸醌脫氫酶、酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶和固氮酶鐵蛋白。操作簡單，便于使用，且所構建的重組枯草芽孢桿菌完全避免中心碳代謝以溢流、平衡胞內還原力NADH代謝。

本發明的第一個目的是提供一種枯草芽孢桿菌重組菌，所述重組菌整合表達了丙酮酸羧化酶BalpycA、甘油醛-3-磷酸鐵氧還蛋白脫氫酶gapN、異檸檬酸NAD⁺脫氫酶icd、蘋果酸醌脫氫酶mqo、丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶porAB和固氮酶鐵蛋白cyh。

在本發明的一種實施方式中，所述重組菌是以枯草芽孢桿菌BSGNKAP2作為出發菌株，所述枯草芽孢桿菌BSGNKAP2如專利申請號為CN201610517961.9的專利申請所述。