[發明專利]一株重組畢赤酵母、其表達產物及其應用

有效

• 申請號: 201810297225.6
• 申請日: 2018-03-30
• 公開（公告）號: CN110317740B
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發明（設計）人: 劉美艷;宮穎;黃金金;張健;駱鳳;張倩;陳一虹;錢琳娜
• 申請（專利權）人: 江蘇師范大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/56;C12N9/42;A01N63/32;A01P3/00;C12R1/84
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

一株重組畢赤酵母、其表達產物及其應用，利用克隆的甘薯幾丁質酶基因IbChiA與表達載體可操作地連接，得到能夠表達該蛋白的重組表達載體。通過將上述重組表達載體導入恰當的宿主細胞中，獲得表達IbChiA的基因工程菌。本發明還提供一種制備上述IbChiA的方法，其是通過培養pPICZα+IbChiA?X33，經誘導表達獲得幾丁質酶IbChiA。所述誘導條件為每24小時補充一次誘導物甲醇，至甲醇終濃度為1.0％。本發明還提供了上述甘薯幾丁質酶在水解膠體幾丁質及抑制植物病原真菌中的應用。制備的甘薯幾丁質酶對甘薯黑斑病菌和根腐病菌都具有很強的抑菌效果；本發明提供的重組畢赤酵母表達甘薯幾丁質酶方法，胞外分泌量可達403mg/L，以膠體幾丁質為底物，酶活達到20U/ml。

技術領域

本發明涉及分子生物學、基因工程領域，具體地涉及一株重組畢赤酵母、其表達產物及其應用。

背景技術

幾丁質廣泛分布于動物、微生物體內，是僅次于纖維素的第二大可再生資源，年生物合成量達100億噸。幾丁質的降解產物幾丁寡糖是一種具有獨特生理活性的功能性低聚糖，在農業、生物醫學、食品、化妝品等各領域都有廣泛的應用價值，但是目前幾丁質生物資源的開發均以化學方法為主，幾乎都要用到強酸強堿，對環境造成極大的污染。利用幾丁質酶水解幾丁質制備幾丁寡糖具有生產條件溫和可控，對環境污染少的優點，是替代化學方法的理想技術。

在作物病原菌及害蟲的生物防治領域，幾丁質酶通過降解真菌的由幾丁質組成的細胞壁，使其原生質膜破裂，從而抑制病原真菌的孢子萌發和菌絲生長，同時降解產物幾丁寡糖又作為激發子激活植物的防御機制，誘導幾丁質酶和其他抗菌物質的積累，達到抗真菌和細菌的作用；在抗蟲作用方面，幾丁質酶對蘇云金芽孢桿菌制劑有增效作用，提高幼蟲死亡率；在人類的真菌性疾病防治方面，幾丁質酶同樣是安全而有效的抗真菌劑，擁有重要而廣闊的醫學應用前景。

因此研究和利用幾丁質酶將具有重大的經濟價值與理論價值，隨著對幾丁質酶的需求增加，用優秀的基因工程菌生產大量的高活性的幾丁質酶將是必然趨勢。

發明內容

本發明的第一個目是提供包含上述重組表達載體畢赤酵母菌株；本發明的第二個目的是提供一種制備上述幾丁質酶的方法；本發明的第三個目的是提供甘薯幾丁質酶在抑制植物病原真菌中的應用；本發明的第四個目的是提供甘薯幾丁質酶在水解幾丁質中的應用。

為了實現以上發明目的，本發明利用克隆的甘薯幾丁質酶基因IbChiA與表達載體可操作地連接，得到能夠表達該蛋白的重組表達載體。

將上述重組表達載體導入恰當的宿主細胞中，獲得表達IbChiA的基因工程菌。

本發明還提供一種制備上述IbChiA的方法，其是通過培養pPICZα+IbChiA-X33，經誘導表達獲得幾丁質酶IbChiA。所述培養條件為28℃，初始pH為7，200rpm培養144小時。所述誘導條件為每24小時補充一次誘導物甲醇，至甲醇終濃度為1.0％。

本發明還提供了上述甘薯幾丁質酶在水解幾丁質及抑制植物病原真菌中的應用。

本發明的有益效果：本發明制備的甘薯幾丁質酶對甘薯黑斑病菌和根腐病菌都具有很強的抑菌效果，為該酶在農業和工業的應用奠定了基礎；本發明提供的重組畢赤酵母表達甘薯幾丁質酶方法，胞外分泌量可達403mg/L，以幾丁質為底物，酶活達到20U/ml。

附圖說明

圖1為表達質粒構建流程圖；

圖2為表達質粒雙酶切電泳圖，其中，泳道1：DNA標準分子量；泳道2：空質粒pPICZα經EcoR I和Kpn I雙酶切后的結果；泳道3：表達質粒pPICZα+IbChiA經EcoR I和Kpn I雙酶切后的結果；