[發明專利]基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病種質篩選方法及其應用

有效

• 申請號: 201810293806.2
• 申請日: 2018-04-04
• 公開（公告）號: CN108486272B
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發明（設計）人: 程鴻;孔維萍;李繼平
• 申請（專利權）人: 甘肅省農業科學院蔬菜研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851
• 代理公司: 蘭州錦知源專利代理事務所(普通合伙) 62204
• 代理人: 勾昌羽

1.基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病種質篩選方法，其特征在于包括如下步驟：

A、取白粉病菌源孢子接種在待接種甜瓜葉片上，白粉病菌源在目標甜瓜葉片輕輕摩擦進行接種；

B、目標甜瓜葉片感染后培養三天待白粉病菌源入侵細胞后進行分子生物學鑒定，提取甜瓜感染葉片和未感染白粉病菌的RNA樣品；

C、取步驟B中RNA樣品1.0-10.0μL，RNA樣品加入反轉錄混合液中，反轉錄混合液由PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0μL、RT Primer Mix 1.0μL、5×PrimeScript Buffer4.0μL和RNase Free dH₂O 4.0μL組成，7℃反應15 min，85℃反應5sec進行酶失活，降溫至4℃，制得反轉錄產物cDNA 模板；

D、利用特定引物進行PCR擴增，特定引物P1為 GCATCGGGATATGCACAAGTC、P2為ATACTCGGTGAGCTATTGATG，冰盒上制備擴增混合液，擴增混合液由5×gDNA Eraser Buffer2.0μL、gDNA Eraser 1.0μL和步驟C中反轉錄產物cDNA 模板1μL組成，再加入 RNase FreedH₂O至總體積10μL，擴增混合液放置于4℃環境下；

F、冰上融化abm?EvaGreen qPCR MasterMix-ROX 10.0μL、步驟D中的擴增混合液 1.6μL、步驟C中反轉錄產物cDNA 模板1μL和滅菌蒸餾水dH₂O7.4 μL，并以每分鐘2000轉進行離心后使用；加入 96 孔板后，95℃變性10 min，進行循環變性94℃處理15 sec，60℃退火處理1min，重復40-45 遍；使用定量 PCR 儀進行分析測定CmROR2基因的表達量；

G、使用 2-ΔΔCt 法對表達量進行分析，接種病菌前至接種3天后，CmROR2基因的表達量增長200%以上，作為篩選抗性種質的指標用于抗性品種選育。

2.根據權利要求1所述的基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病種質篩選方法，其特征在于所述步驟A的甜瓜葉片的培育步驟如下：甜瓜種子在55℃溫水中浸泡20分鐘，在常溫25℃中浸泡8小時，放置于28℃氣候箱中催芽，兩天后，將露白的種子播種在消毒基質中，消毒基質配方按質量分數配制肥田土50%、腐熟牲畜糞便40%和爐灰10%，3-5天出苗后轉入苗期管理，苗期環境溫度為白天25℃，夜間20℃，環境濕度60%。

3.根據權利要求2所述的基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病種質篩選方法，其特征在于所述步驟A苗期管理期間光照時間16小時，黑暗時間8小時。

4.根據權利要求1所述的基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病種質篩選方法，其特征在于所述步驟C反轉錄使用試劑盒RR047A處理，得到反轉錄產物。

5.根據權利要求1所述的基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病種質篩選方法，其特征在于所述步驟F中abm?EvaGreen qPCR MasterMix-ROX 使用時上下顛倒搖晃混合，避免反應液起泡。

6.根據權利要求1所述的基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病種質篩選方法的應用，其特征在于所述步驟G中CmROR2基因的表達量增長300%，作為篩選抗性種質的指標用于抗性品種選育。

7.根據權利要求1所述的基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病種質篩選方法，其特征在于所述步驟F中使用ABI STEP ONE PLUS定量 PCR 儀。