[發(fā)明專(zhuān)利]緩釋IGF-1生長(zhǎng)因子的肌肉脫細(xì)胞材料的制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810293743.0
• 申請(qǐng)日: 2018-04-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108514657A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-09-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林賢豐;范順武;王剛良;王藝蕓;陳家鑫;王晟毓
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): A61L27/36
• 分類(lèi)號(hào): A61L27/36;A61L27/54
• 代理公司: 杭州求是專(zhuān)利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 忻明年

本發(fā)明提出了一種緩釋IGF?1生長(zhǎng)因子的肌肉脫細(xì)胞材料的制備方法，本發(fā)明將哺乳動(dòng)物任意大小的骨骼肌肉組織經(jīng)含蛋白酶抑制劑的PBS、含KCl的PBS緩沖液、含Triton X的PBS緩沖液、含SDS的PBS緩沖液、含DNA酶的PBS緩沖液處理，獲得可自發(fā)、持續(xù)緩釋IGF?1生長(zhǎng)因子的脫細(xì)胞肌肉材料。本發(fā)明能同時(shí)對(duì)肌肉組織上的細(xì)胞進(jìn)行完全去細(xì)胞化處理，且條件溫和、無(wú)ECM損害、快速穩(wěn)定，所得肌肉脫細(xì)胞材料不僅可以自發(fā)、持續(xù)緩釋IGF?1生長(zhǎng)因子，還具有生物相容性好、可塑性強(qiáng)、生物力學(xué)強(qiáng)度高等優(yōu)點(diǎn)，可用于修復(fù)臨床上各類(lèi)病因造成的肌肉損傷、退變相關(guān)疾病。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明主要涉及用于全身骨骼肌肉組織修復(fù)及其再生的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體是一種新型的肌肉脫細(xì)胞材料的制備，該生物支架能自發(fā)持續(xù)釋放IGF-1-1生長(zhǎng)因子，且較好的保留了天然肌肉組織的細(xì)胞外基質(zhì)成分，該材料能促進(jìn)大面積肌肉缺損的修復(fù)和再生。

背景技術(shù)

雖然骨骼肌在損傷之后有一定的自我修復(fù)能力，但是急性、超過(guò)20％面積的肌肉損傷常常導(dǎo)致缺損處無(wú)法修復(fù)，往往由大量的疤痕纖維組織替代，我們稱(chēng)之為大面積肌肉缺損。目前，沒(méi)有有效治療手段能促進(jìn)大面積肌肉缺損的修復(fù)和再生。

在骨骼肌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)重塑和肌肉再生過(guò)程中，通過(guò)釋放一系列生長(zhǎng)因子,激活肌衛(wèi)星細(xì)胞促進(jìn)肌纖維分化，并最終促進(jìn)骨骼肌再生。因此，生長(zhǎng)因子對(duì)肌肉再生有著重要的意義。而胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1-1)通過(guò)促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞增殖和肌原性的分化，血管內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的血管生成以及神經(jīng)元存活和軸突再生等多種途徑而強(qiáng)有力的促進(jìn)肌肉修復(fù)再生。但是通過(guò)傳統(tǒng)技術(shù)制備的肌肉脫細(xì)胞材料，其IGF-1生長(zhǎng)因子往往不能被很好保留，更無(wú)法達(dá)到持續(xù)緩釋。能夠自發(fā)、持續(xù)緩釋IGF-1生長(zhǎng)因子的脫細(xì)胞肌肉支架還未見(jiàn)報(bào)道。

單獨(dú)的應(yīng)用IGF-1或者將IGF-1加到人工合成材料中去修復(fù)大面積肌肉缺損結(jié)果并不理想，因?yàn)榧⌒l(wèi)星細(xì)胞的增殖分化需要在數(shù)天后(3-7天)，而目前報(bào)道的IGF-1釋放的最大效能只維持在10-24小時(shí)之間。而且人造的合成材料相較于天然的肌肉ECM缺少天然的細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育所需微環(huán)境，無(wú)法實(shí)現(xiàn)很好的肌肉修復(fù)再生。因此本發(fā)明通過(guò)創(chuàng)新的脫細(xì)胞技術(shù)制備能自發(fā)、持續(xù)釋放IGF-1生長(zhǎng)因子的新型脫細(xì)胞肌肉生物支架，并且證實(shí)該支架在體內(nèi)能很好的修復(fù)大面積的肌肉缺損同時(shí)能恢復(fù)受損肌肉組織中的血管和神經(jīng)再生，在肌肉再生組織工程中有極大的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于填補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)中，脫細(xì)胞肌肉材料不能保留并且緩釋IGF-1生長(zhǎng)因子而影響肌肉缺損的修復(fù)再生，提供一種能自發(fā)、持續(xù)釋放IGF-1生長(zhǎng)因子，并且較好促進(jìn)大面積肌肉缺損再生的新型脫細(xì)胞肌肉生物支架的制備方法。

(1)取12h以?xún)?nèi)宰殺的任意哺乳動(dòng)物的骨骼肌肉組織，用剪刀除去肌肉上的脂肪，用含蛋白酶抑制劑的生理鹽水漂洗3次，每次20min，去除血液，貼附的脂肪碎片和其他雜質(zhì)。

(2)在含蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液中，在4o C溫度下用搖床100rpm震蕩24-48小時(shí)；然后用液氮凍融3個(gè)循環(huán)；

(3)在KCL的PBS緩沖液中，加入混合抗菌液，在4o C溫度下用搖床100rpm震蕩2-12小時(shí)；

(4)在含Triton X的PBS緩沖液中，加入混合抗菌液，在4o C溫度下用搖床100rpm震蕩8-24小時(shí)；

(5)在含NaCL的PBS緩沖液中，在4o C溫度下用搖床100rpm震蕩2-12小時(shí)；

(6)在含SDS的PBS緩沖液中，加入混合抗菌液，在4o C溫度下用搖床100rpm震蕩8-24小時(shí)；

(7)在含DNA酶的PBS緩沖液中，加入混合抗菌液，37℃搖床100rpm震蕩6-12小時(shí)；

步驟(2)-(7)中，每個(gè)步驟完成后均用生理鹽水沖洗5小時(shí)。